實驗一組織或細胞總RNA制備和反轉錄
　　一、實驗目的
　　1.掌握制備細胞或組織總RNA的原理和方法。
　　2.掌握RNA反轉錄為cDNA的原理和方法。
　　二、實驗原理
　　總RNA提取試劑盒可從各種細胞或組織中快速提取總RNA，可同時處理大量不同樣品。裂解液中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚，其中異硫氰酸胍可裂解細胞，促使核蛋白體解離，使RNA與蛋白質分離，并將RNA釋放到溶液中。當加入氯仿時，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA進入水相，離心后可形成水相層、中間層和有機層（下層），這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質和DNA分離開。水相層（無色）主要為RNA，有機層（黃色）主要為DNA和蛋白質。整個操作可在1h內完成，提取的總RNA沒有DNA和蛋白質的污染，可用于Northernblot、Dotblot、polyA篩選、體外翻譯、RNase保護分析和分子克隆。
　　三、材料、試劑與儀器
　　1.材料
　　2.試劑
　　新鮮全血。
　　總RNA提取試劑盒（表1-1）、氯仿、RNA-freeddH2O、反轉錄試劑盒（表1-2）。
　　表1-1總RNA提取試劑盒內容
　　2分子生物學基本技術實驗指導
　　續(xù)表
　　表1-4反轉錄引物的選擇
　　圖1-1陽性對照簡圖
　　3.儀器
　　低溫臺式高速離心機、低溫冰箱、紫外檢測儀、電泳儀、電泳槽、微量移液器、微量移液器吸頭等。
　　4分子生物學基本技術實驗指導
　　四、實驗步驟
　　（一）總RNA提取
　　**次使用前應在去蛋白液RD、漂洗液RW中加入無水乙醇，加入量請參見瓶上標簽。
　�。�1）樣品處理如下。
　　1）組織：將組織在液氮中磨碎。每50～100mg組織加1ml裂解液RZ，用刀漿儀進行刀漿處理。樣品體積應不超過裂解液RZ體積的1/10。
　　2）單層培養(yǎng)細胞：直接在培養(yǎng)板中加入裂解液RZ裂解細胞，每10cm2面積加1ml裂解液RZ。用移液器吹打幾次。
　　注意：裂解液RZ的加入量根據(jù)培養(yǎng)瓶面積決定，不是由細胞數(shù)決定。如果加入量不足，可能導致提取的RNA中有DNA污染。
　　3）細胞懸液：離心取細胞，棄上清。每5×106～10×106動物細胞或植物細胞加入1ml裂解液RZ。加裂解液RZ前不要洗滌細胞，以免降解mRNA。
　　4）血液：直接取新鮮血液，加入3倍體積的裂解液RZ（推薦0.25ml血液＋0.75ml裂解液RZ），充分振蕩混刀。
　�。�2）將刀漿樣品在15～30℃放置5min，使得核蛋白體完全分離。
　�。�3）可選步驟：4℃，12000r/min離心5min，取上清，轉入一個新的無RNase的離心管中。
　　注意：如果樣品中含有較多蛋白質、脂肪、多糖或肌肉、植物結節(jié)部分等，可加此步驟離心去除。離心得到的沉淀中包括細胞外膜、多糖、高分子量DNA，RNA存在于上清溶液中。
　�。�4）加入200μl氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15s，室溫放置3min。
　�。�5）4℃，12000r/min離心10min，樣品會分成3層：黃色的有機相，中間層和無色的水相，RNA主要在水相中，水相的體積約為所用裂解液RZ的50%。把水相轉移到新管中，進行下一步操作。
　　（6）緩慢加入0.5倍體積無水乙醇，混刀（此時可能會出現(xiàn)沉淀）。將得到的溶液和沉淀一起轉入吸附柱CR3中，4℃，12000r/min離心30s，若一次不能將全部溶液和混合物加入吸附柱CR3，可分兩次轉入，再4℃，12000r/min離心30s，棄掉收集管中的廢液。
　�。�7）向吸附柱CR3中加入500μl去蛋白液RD（使用前請先檢查是否已加入乙醇），4℃，12000r/min離心30s，棄廢液。
　�。�8）向吸附柱CR3中加入700μl漂洗液RW（使用前請先檢查是否已加入乙
　　醇），室溫靜置2min，4℃，12000r/min離心30s，棄廢液。
　　（9）向吸附柱CR3中加入500μl漂洗液RW，室溫靜置2min，4℃，12000r/min離心30s，去除殘余液體。
　�。�10）將吸附柱放入2ml收集管中，4℃，12000r/min離心2min，去除殘余液體
　�。ㄗ⒁猓捍瞬襟E目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，離心后將吸附柱CR3在室溫放置片刻，或置于超凈工作臺上通風片刻，以充分晾干。如果有漂洗液殘留，可能會影響后續(xù)的反轉錄等實驗操作）。
　�。�11）將吸附柱CR3轉入一個新的離心管中，加30～100μlRNase-freeddH2O，室溫放置2min，4℃，12000r/min離心2min。洗脫緩沖液體積應不少于30μl，體積過小影響回收效率。且RNA應保存在.70℃，以防降解。
　　注意：如果想提高RNA得率，可重復上步操作一次，合并兩次得到的溶液。
　�。ǘ�）反轉錄
　　合成的cDNA引物可結合實際情況從OligodT-AdaptorPrimer、Random9mers或特異性下游引物中任選一種。
　　（1）按表1-5配制反轉錄反應液。
　　（2）按以下條件進行反轉錄反應。
　　使用Random9mers進行反轉錄時，首先在30℃下保溫10min，使Random9mers延伸達到足夠長度，以便在42～55℃退火時與模板RNA充分結合。
　　五、RNA質量的判斷
　　（一）完整性判斷
　　通常使用瓊脂糖凝膠電泳判斷RNA的完整性。理論上，完整的RNA擁有28S∶18S=2.6∶1左右的比例（即相對分子質量之比）。由于大分子rRNA的二級及三級結構程度更高。較小分子的rRNA更容易降解，再加上RNA電泳受許多因素影響，包括電泳條件、上樣量、被EB飽和的程度等，因此準確評估28S∶18S并不容易。另外，來自不同器官組織，在確定其mRNA沒有降解的前提下，其比例也有區(qū)別（如肝和肺的比例較低）�？梢哉f，2∶1是高質量的標準，但低于2∶1并不就是質量低。一般的，如果28S和18S條帶清晰，且28S∶18S＞1，該完整性就可以滿足絕大部分后續(xù)實驗。如圖1-2所示。
　　圖1-21%瓊脂糖RNA電泳圖1～3.RNA樣品，28S∶18S=2.6∶1
　　（二）純度的判斷
　　260nm、320nm、230nm、280nm下的吸光度分別代表了核酸、背景（溶液渾

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