第1章 實(shí)驗(yàn)室與實(shí)驗(yàn)的一般規(guī)則
1.1 實(shí)驗(yàn)室一般規(guī)則
1.1.1 實(shí)驗(yàn)室規(guī)則要點(diǎn)
（1）每個同學(xué)都應(yīng)遵守學(xué)習(xí)紀(jì)律，維護(hù)實(shí)驗(yàn)室秩序，保持室內(nèi)安靜，不大聲說笑或喧嘩。
（2）實(shí)驗(yàn)前認(rèn)真做好預(yù)習(xí)，明確目的和要求，了解本次實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的基本原理和操作步驟。
（3）在實(shí)驗(yàn)過程中聽從教師的指導(dǎo)，嚴(yán)肅認(rèn)真地按操作規(guī)程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并簡要、準(zhǔn)確地將實(shí)驗(yàn)結(jié)果及原始數(shù)據(jù)記錄在專用的實(shí)驗(yàn)記錄本上，養(yǎng)成良好的、實(shí)事求是的科學(xué)作風(fēng)。課后及時總結(jié)復(fù)習(xí)，根據(jù)原始記錄進(jìn)行整理，并寫出實(shí)驗(yàn)報(bào)告，按時送交任課教師評閱。
（4）保持實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和儀器的整潔是做好實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。必須維持實(shí)驗(yàn)桌面及試劑藥品架上的清潔整齊，不要亂放和亂扔，儀器和試劑藥品放置要井然有序。公用試劑藥品用畢后立即蓋好放回原處，要特別注意保持藥品及試劑的純凈，嚴(yán)禁混雜。
（5）使用儀器、藥品、試劑和各種器材都必須注意愛護(hù)及節(jié)約，不得浪費(fèi)。洗滌和使用玻璃儀器時，應(yīng)謹(jǐn)慎仔細(xì)，防止損壞；在使用貴重精密儀器時，應(yīng)嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，發(fā)現(xiàn)故障立即報(bào)告教師，不要擅自動手拆散和檢修。
（6）廢棄溶液可倒入水槽內(nèi)，但強(qiáng)酸、強(qiáng)堿溶液必須先用水稀釋后，再放水沖走。強(qiáng)腐蝕性廢棄試劑藥品、廢紙及其他固體廢物或帶有渣滓沉淀的廢液均應(yīng)倒入廢品缸內(nèi)，不能倒入水槽內(nèi)。
（7）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)一切物品，未經(jīng)本室教師許可，嚴(yán)禁攜出室外，借物時必須辦理登記手續(xù)。儀器損壞時，應(yīng)隨即向教師報(bào)告，如實(shí)說明情況并認(rèn)真登記后方可補(bǔ)領(lǐng)。
（8）必須遵守和熟悉實(shí)驗(yàn)室安全規(guī)章及防護(hù)知識，不得違反和破壞。禁止在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)吸煙。使用電爐時應(yīng)有人在旁，不可擅自離開不管，用畢后切記斷電。
（9）每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，應(yīng)各自將儀器清理放置（部分玻璃器皿需倒置安放），并整理好實(shí)驗(yàn)桌面上的物品。值日生要負(fù)責(zé)當(dāng)日實(shí)驗(yàn)室的衛(wèi)生和安全檢查，做好全部清理工作，離開實(shí)驗(yàn)室前應(yīng)關(guān)上水、電、燃?xì)狻㈤T窗等，嚴(yán)防安全隱患事故的發(fā)生。
（10）對實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和安排不合理之處可提出改進(jìn)意見，做到教學(xué)相長。對實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的一切反�，F(xiàn)象可開展分析和討論。
（11）洗凈的儀器要放在架上或干凈的紗布上晾干，不能用抹布擦拭，更不能用抹布擦拭儀器內(nèi)壁。
（12）挪動干凈玻璃儀器時，勿使手指接觸儀器內(nèi)部。
（13）取出的試劑和標(biāo)準(zhǔn)溶液，如未用盡，切勿倒回原試劑瓶內(nèi)，以免摻混。
（14）凡是發(fā)生煙霧、有毒氣體及有臭味氣體的實(shí)驗(yàn)，必須在通風(fēng)櫥內(nèi)進(jìn)行。
（15）用實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時，不許戲弄動物。進(jìn)行殺死或解剖等操作，應(yīng)按規(guī)定方法進(jìn)行，絕對不能用動物、手術(shù)器械或藥物開玩笑。
（16）一般容量儀器的容積都是在20℃下校準(zhǔn)的。使用時如溫差在5℃以內(nèi)，容積改變不大，可以忽略不計(jì)。
1.1.2 實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)施的使用
1.1.2.1 生物工程實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)儀器、設(shè)備
1.溫度控制系統(tǒng)
（1）冰箱：根據(jù)藥品、試劑及多種生物制劑保存的需要，必須具備不同控溫級別的冰箱，最常使用的有4℃、-20℃、-80℃冰箱。
4℃適合儲存某些溶液、試劑、藥品等。-20℃適合某些試劑、藥品、酶、血清、配好的抗生素、DNA和蛋白質(zhì)樣品等的保存。-80℃適合某些長期低溫保存的樣品、純化的樣品、特殊的低溫處理消化液等的保存。
0～10℃的冷柜適合低溫條件下的電泳、層析、透析等實(shí)驗(yàn)。
（2）液氮罐：有些實(shí)驗(yàn)材料、某些器官組織、細(xì)胞株、菌株及純化的樣品等，要求速凍和長期保存在超低溫環(huán)境下，就需要一個液氮罐（-196℃），其具有經(jīng)濟(jì)、省力和較好地保持細(xì)胞生物學(xué)特性的優(yōu)點(diǎn)。
（3）培養(yǎng)箱：37℃恒溫箱用于細(xì)菌的固體培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)。CO2培養(yǎng)箱適用于培養(yǎng)各種細(xì)胞，可恒定地提供一定量的CO2（通常5%），用來維持
培養(yǎng)液的酸度（pH）。37℃恒溫空氣搖床可進(jìn)行液體細(xì)菌的培養(yǎng)。
（4）水浴鍋：用于保溫。25～100℃水浴搖床可用于分子雜交實(shí)驗(yàn)及各種生物化學(xué)酶反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)的保溫。25～100℃水浴箱用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)。
（5）烘箱：主用于烘干實(shí)驗(yàn)器皿，有些需要溫度高些，有些需要溫度低些。用于RNA方面的實(shí)驗(yàn)用具，需要在250℃烘箱中烘干，有些塑料用具只能在42～45℃的烘箱中進(jìn)行烘干。2.水的凈化裝置隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，許多實(shí)驗(yàn)對水純度的要求越來越高。常用的水的凈化裝置有以下幾種。
（1）蒸餾水器：單蒸水常難以滿足實(shí)驗(yàn)要求，可用雙蒸水、三蒸水配液。多次蒸餾水可除去水中非揮發(fā)性雜質(zhì)，不能完全除去水中溶解的氣體雜質(zhì)。
（2）離子交換器：用離子交換法制取的水，稱為去離子水，其去離子效果好，但不能除去水中的非離子型雜質(zhì)，其中常含有微量的有機(jī)物（樹脂等）。
（3）超純水：用蒸餾水、離子交換水、反滲透純水作為供水，用磁鐵耦合齒輪泵作用使
水循環(huán)。超純水用于PCR、氨基酸分析、DNA測序、酶反應(yīng)、組織和細(xì)胞培養(yǎng)等。3.菌消毒設(shè)備
（1）蒸汽消毒鍋：用于小批量物品的隨時消毒。大批實(shí)驗(yàn)物品、試劑、培養(yǎng)基可使用大型消毒器定時進(jìn)行消毒。
（2）紫外線、75%乙醇、0.1%SDS（消毒劑）。一些不耐高壓、高溫消毒的用具可用紫外線照射，或用乙醇和SDS浸泡。紫外線照射使用方便，但滅菌效果與距離有關(guān)，且產(chǎn)生臭氧污染，常用于無菌室、超凈臺和塑料用具的消毒。
（3）濾器濾膜：不耐高溫、高壓的試劑用其除菌。
（4）煮沸消毒：主要用于金屬器械的消毒和急需時采用。4.計(jì)量系統(tǒng)
（1）稱量系統(tǒng)：（各種天平）臺秤、托盤天平、鈕力擺動天平、光電分子天平、精密電子分析天平。
（2）液體體積的度量。精量器：移液管、微量取液器。粗量器：刻度試管、燒杯、錐形瓶、量筒。
（3）pH測量。pH計(jì)：測定溶液中H+ 的直接電位的儀器，主要通過一對電極，在不同的pH溶液中產(chǎn)生不同的電動勢，用pH表示出來。
pH試紙：只適用于培養(yǎng)液、酚飽和液、緩沖液或其他試劑溶液pH的粗略估計(jì)；而大部分試劑配制嚴(yán)格要求pH，需精確度高（小數(shù)點(diǎn)后兩位）的pH計(jì)。
（4）OD值測量：光密度計(jì)、分光光度計(jì)是利用物質(zhì)在可見光和紫外線區(qū)域中的吸收光譜來鑒定該物質(zhì)的性質(zhì)及含量的一種儀器。它由光源、單色器、吸收池、接收器、測量儀表或顯示屏幕所組成。OD值是許多溶液中溶質(zhì)定量的方便指標(biāo)之一，通過所產(chǎn)生的單色光來測定某一溶液對該單色光的吸收值，利用它可進(jìn)行核酸溶液定量和純度的初步判斷。
5.離心機(jī)
離心技術(shù)是研究生物結(jié)構(gòu)和功能不可缺少的一種物理技術(shù)手段。因?yàn)楦鞣N物質(zhì)在沉淀系數(shù)、浮力和質(zhì)量等方面有差異，可利用強(qiáng)大的離心力場，使其分離、純化和濃縮。目前有各種各樣的離心機(jī)，可供少于0.05mL到幾升的樣品離心之用。離心技術(shù)應(yīng)用廣泛，包括收集和分離細(xì)胞、細(xì)胞器和生物大分子等。據(jù)其轉(zhuǎn)速的不同，離心機(jī)可分為以下幾種類型。
（1）常速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速8000r/min，最大離心力10000g。醫(yī)用或臺式離心機(jī)：是離心機(jī)中最簡單而廉價(jià)的，最常用于收集快速沉降系數(shù)的物質(zhì)，
如紅細(xì)胞、粗大的沉淀物、酵母菌和細(xì)菌等。低速冷凍離心機(jī)：主要用于細(xì)胞、細(xì)胞核、細(xì)胞膜及細(xì)菌的沉淀和收集等。
（2）高速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速25000r/min，最大離心力100000g。有冷凍和常溫兩種，多用于制備和收集微生物、細(xì)胞碎片、細(xì)胞、大的細(xì)胞器、硫酸銨沉淀物及免疫沉淀物等。
（3）超速離心機(jī)：最大轉(zhuǎn)速120000r/min，最大離心力500000g。主要用于DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子以及細(xì)胞器、病毒等的分離純化；樣品純度檢測；沉降系數(shù)和相對分子質(zhì)量的測定等。
6.超凈工作臺
內(nèi)有紫外燈、照明燈，還應(yīng)有酒精燈火焰、75%乙醇等滅菌的設(shè)備，是一種提供局部潔凈度的設(shè)備。其原理是鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動空氣，經(jīng)過低、中效的過濾器后，通過工作臺面，使實(shí)驗(yàn)操作區(qū)域成為無菌的環(huán)境。超凈臺按氣流方向的不同大致分為如下幾種類型。
（1）側(cè)流式：凈化后，氣流從左側(cè)或右側(cè)通過工作臺面流向?qū)��?cè)，或者從上往下或從下往上流向?qū)��?cè)，它們都能形成氣流屏障而保障臺面無菌。
缺點(diǎn)：在凈化氣流和外面氣體交界處，可由氣體的流向而出現(xiàn)負(fù)壓，使少量的未凈化氣體混入，而造成污染。
（2）外流式：氣流面向操作人員的方向流動，從而保證外面氣體不能混入。缺點(diǎn)：在進(jìn)行有害物質(zhì)實(shí)驗(yàn)時，對操作人員不利，但可采用有機(jī)玻璃把上半部分遮擋起
來，使氣流從下方流出。
7.電泳系統(tǒng)
電泳技術(shù)用于檢測、鑒定各種生物大分子的純度、含量及描述它們的特征，甚至還是分
離、純化、回收和濃縮樣品的技術(shù)之一。核酸和蛋白質(zhì)等都帶有電荷，當(dāng)它們被置于電場中時，能夠移動。電泳裝置由兩部分組成：電源裝置和電泳槽裝置。
（1）電源裝置：電源需通過穩(wěn)壓器穩(wěn)流，既能提供穩(wěn)定的直流電，又能輸出穩(wěn)定的電
壓，可用于三種電泳儀。常度穩(wěn)壓電泳儀：輸出電壓0～500V，0～15mA；中度穩(wěn)壓電泳儀：輸出電壓400～1000V；高度穩(wěn)壓電泳儀：輸出電壓1000V以上的電源裝置。
（2）電泳槽裝置：可分為以下兩種。水平式電泳槽：一般分為微型電泳槽和大號水平式電泳槽；垂直式電泳槽：分垂直平板電泳槽和圓柱形電泳槽裝置。8.PCR儀PCR（polymerasechainreaction）儀也稱DNA熱循環(huán)儀、基因擴(kuò)增儀，它使一對寡核
苷酸引物結(jié)合到正負(fù)DNA鏈上的靶序列兩側(cè)，從而酶促合成拷貝數(shù)百萬倍的靶序列DNA片段。它的每一循環(huán)包括在三種不同溫度下進(jìn)行的DNA變性、引物復(fù)性、DNA聚合酶催化的延伸反應(yīng)三個過程。
9.凝膠成像分析系統(tǒng)對電泳后含溴化乙錠（EB）核酸樣品的觀察分析。10.干燥設(shè)備
（1）真空加熱干燥箱：適用于熱敏性、易分解、易氧化和復(fù)雜成分物料的快速干燥。
（2）電泳凝膠干燥箱：對電泳后的凝膠進(jìn)行脫水干燥的儀器，一般可將凝膠干燥到一些玻璃紙上，干燥后的凝膠易于保存。
（3）液氮冷凍干燥：適用于活性蛋白質(zhì)樣品的干燥與結(jié)晶。
（4）真空泵：許多實(shí)驗(yàn)都需要抽真空，如乙醇沉淀后核酸樣品的干燥、電泳凝膠的干燥等。11.其他
（1）微波爐：便于一些溶液的快速加熱和定溫加熱，電泳瓊脂糖凝膠配制、溶化等。
（2）制冰機(jī)：用于制造大多數(shù)核酸、蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)操作所需的低溫環(huán)境，以減少核酸酶或蛋白酶的水解。
（3）層析裝置：（色譜分離）是一種分離多組分混合物的有效物理方法。
（4）磁力攪拌器：多角度旋轉(zhuǎn)混勻器、快速振蕩混合器，用于混合液體和液固樣品的儀器。
（5）組織勻漿器：超聲組織及細(xì)胞破碎器，用其進(jìn)行樣品的分離提純實(shí)驗(yàn)。
（6）通風(fēng)櫥：很多溶劑能逸出毒氣，故必備通風(fēng)裝置，放射性實(shí)驗(yàn)還要有有機(jī)玻璃屏蔽。
（7）玻璃蒸餾器、電熱加帽、變壓器：用于酚等有機(jī)溶劑的蒸餾。
（8）真空印記系統(tǒng)、DNA合成/測序儀：這些都是對核酸進(jìn)行深入研究的必備儀器。
（9）吸頭、Eppendorf管（EP管）：微管移液器吸頭（吸液尖）、EP管（微量離心管）可洗滌，用硅化消毒后可反復(fù)使用。對一些要求嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)，如RNA的提取、保存等操作，應(yīng)使用新的消毒吸頭與EP管。另外還應(yīng)備有常用規(guī)格的離心管（1000mL、500mL、250mL、50mL、7mL等）及96孔、24孔、12孔、6孔的細(xì)胞培養(yǎng)塑料平板等。
（10）
小型設(shè)備、用具：定時器、濾膜、保鮮膜、防護(hù)眼鏡、鴨嘴鑷、常規(guī)的玻璃或塑料器皿（包括平皿、試管、燒杯、量瓶、試劑分液漏斗，避光保存的試劑應(yīng)使用棕色試劑瓶，如飽和酚、巰基乙醇等）、記號筆、各種手套（PE、乳膠、家用、防酸的等）。
1.1.2.2 部分設(shè)備的使用方法
1.恒溫空氣搖床的使用
（1）將樣品瓶牢固放入彈簧夾中；
（2）接通電源開關(guān)，儀器進(jìn)入準(zhǔn)備狀態(tài)；
（3）參數(shù)設(shè)定（設(shè)定溫度、時間、轉(zhuǎn)速等參數(shù)）；
（4）按啟動鍵儀器開始工作，按暫停鍵可暫停托盤的旋轉(zhuǎn)；
（5）按電源鍵，顯示屏顯示消失，關(guān)閉電源總開關(guān)。2.超凈工作臺的使用
（1）使用工作臺時，先用經(jīng)清潔液浸泡的紗布擦拭臺面，然后用消毒劑擦拭消毒。
（2）接通電源，提前30min打開紫外燈照射消毒，處理凈化工作區(qū)內(nèi)工作臺表面積累的微生物，15min后，關(guān)閉紫外燈，開啟鼓風(fēng)機(jī)。
（3）工作臺面上，不要存放不必要的物品，以保持工作區(qū)內(nèi)的潔凈氣流不受干擾。
（4）操作結(jié)束后，清理工作臺面，收集各廢棄物，關(guān)閉風(fēng)機(jī)及照明開關(guān)，用清潔劑及消毒劑擦拭消毒。
（5）最后開啟工作臺紫外燈，照射消毒30min后，關(guān)閉紫外燈，切斷電源。3.低溫臺式高速離心機(jī)的使用
（1）把離心機(jī)置于平面桌或平面臺上，目測使之平衡，用手輕搖一下離心機(jī)，檢查離心機(jī)是否放置平衡。
（2）打開門蓋，將離心管放入轉(zhuǎn)子內(nèi)，離心管必須成偶數(shù)對稱放入，且要事先平衡，完畢用手輕輕旋轉(zhuǎn)一下轉(zhuǎn)子體，使離心管架運(yùn)轉(zhuǎn)靈活。
（3）關(guān)上門蓋，注意一定要使門蓋鎖緊，完畢后用手檢查門蓋是否關(guān)緊。
（4）插上電源插座，按下電源開關(guān)（電源開關(guān)在離心機(jī)背面、電源座上方）。
（5）設(shè)置轉(zhuǎn)子號、轉(zhuǎn)速、時間：在停止?fàn)顟B(tài)下，用戶可以設(shè)置轉(zhuǎn)子號、轉(zhuǎn)速、時間，此時離心機(jī)處于設(shè)置狀態(tài)，停止燈亮、運(yùn)行燈閃爍；按下啟動鍵離心開始（常用，最高轉(zhuǎn)速為13000r/min，時間最長為20min）。
注意：對應(yīng)的轉(zhuǎn)子一定要設(shè)置在相應(yīng)的轉(zhuǎn)速范圍內(nèi)，不可超速使用，否則對試管或轉(zhuǎn)子有損壞。
（6）離心機(jī)時間倒計(jì)時到“0”時，離心機(jī)將自動停止，當(dāng)轉(zhuǎn)子停轉(zhuǎn)后，打開門蓋取出離心管，關(guān)閉電源開關(guān)。
4.微量移液器的使用
（1）將微量移液器裝上吸頭（不同規(guī)格的移液器用不同的吸頭）。
（2）將微量移液器按鈕輕輕壓至第一停點(diǎn)。
（3）垂直握持微量移液器，使吸嘴浸入液面下幾毫米，千萬不要將吸嘴直接插到液體底部。
（4）緩慢、平穩(wěn)地松開控制按鈕，吸上樣液；否則液體進(jìn)入吸嘴太快，會導(dǎo)致液體倒吸入移液器內(nèi)部，或吸入體積減小。
（5）1s后將吸嘴提離液面。
（6）平穩(wěn)地把按鈕壓到第一停點(diǎn)，再把按鈕壓至第二停點(diǎn)以排出剩余液體。
（7）提起微量移液器，然后按吸頭彈射器除去吸頭。5.PCR的使用
（1）開機(jī)：打開開關(guān)，視窗上顯示“SELFTEST”。
（2）放入樣品管，關(guān)緊蓋子。
（3）如果要運(yùn)行已經(jīng)編好的程序，則直接按“Proceed”，用【箭頭】鍵選擇已儲存的程序，按“Proceed”，則開始執(zhí)行程序。
（4）如果要輸入新的程序，則在RUN-ENTER菜單上用箭頭鍵選擇ENTERPRO-GRAM，按“Proceed”：①命名新的程序，最多8個字母，輸入后按“Proceed”確認(rèn)（如輸入字母、數(shù)字）；②輸入程序步驟：輸入名字后，確認(rèn)，然后輸入相關(guān)程序。
（5）輸入完成的程序后，到RUN-ENTER菜單，選擇新程序，開始運(yùn)行。
（6）其他：用“Pause”可以暫停一個運(yùn)行的程序，再按一次繼續(xù)程序；用“Stop”或
“Cancel”可停止運(yùn)行的程序。6.電泳儀的使用
（1）首先用導(dǎo)線將電泳槽的兩個電極與電泳儀的直流輸出端連接，注意極性不要接反。
（2）按電源開關(guān)，顯示屏出現(xiàn)“歡迎使用DYY-12型電腦三恒多用電泳儀..”等字樣后，同時系統(tǒng)初始化，蜂鳴4聲，設(shè)置常設(shè)值。屏幕轉(zhuǎn)成參數(shù)設(shè)置狀態(tài)，根據(jù)工作需要選擇穩(wěn)壓穩(wěn)流方式及電壓電流范圍。
（3）確認(rèn)各參數(shù)無誤后，按【啟動】鍵，啟動電泳儀輸出程序。在顯示屏狀態(tài)欄中顯示“Start”，并蜂鳴4聲，提醒操作者電泳儀將輸出高電壓，注意安全。之后逐漸將輸出電壓加至設(shè)置值，同時在狀態(tài)欄中顯示“Run”，并有兩個不斷閃爍的高壓符號，表示端口已有電壓輸出。在狀態(tài)欄最下方，顯示實(shí)際的工作時間（精確到秒）。
（4）電泳結(jié)束，儀器顯示“END”，并連續(xù)蜂鳴提醒。此時按任一鍵可止鳴。7.高壓滅菌鍋
（1）開蓋：轉(zhuǎn)動手輪，使鍋蓋離開密封圈，添加蒸餾水至剛沒于板上。
（2）通電：將控制面板上電源開關(guān)按至“ON”處，若水位低（LOW）則紅燈亮。
（3）堆放物品：需包扎的滅菌物品，體積以不超過200mm×100mm×100mm為宜，各包裝之間留有間隙，堆放在金屬框內(nèi)，這樣有利于蒸汽的穿透，提高滅菌效果。滅菌時間為121℃，20min；如為液體，液體必須裝在可耐高溫的玻璃器皿中，且不可裝滿，2/3即可，121℃，18～20min。
（4）密封高壓鍋：推橫梁入立柱內(nèi)，旋轉(zhuǎn)手輪，使鍋蓋下壓，充分壓緊。
（5）設(shè)定時間和溫度，開始滅菌。