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植物基因工程(第二版) 讀者對象:生物(工程)技術(shù)專業(yè)、植物育種等專業(yè)的師生和科研工作者
《植物基因工程》是融匯了近代植物基因工程新理論、新技術(shù)及新成果編寫而成的系統(tǒng)論述植物基因工程原理與技術(shù)的“十二五”高等院校統(tǒng)編教材!吨参锘蚬こ獭穼Φ谝话孢M行了較大的改動,共設(shè)八篇46章,新增了“植物基因變異分子生物學(xué)”、“植物質(zhì)體基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)”及“外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達調(diào)控”等共20余章,最后還增加了第八篇生物信息學(xué)與植物基因工程,新增內(nèi)容為《植物基因工程》的三分之二以上。同時,《植物基因工程》引入了許多最新的圖表及近三年的新文獻,力求圖文并茂,內(nèi)容豐富,既具有較高的專業(yè)水平,又深入淺出,使《植物基因工程》具有多種功能。
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《植物基因工程》既是植物基因工程領(lǐng)域研究人員的參考書,又是高等院校生物技術(shù)相關(guān)專業(yè)本科生及研究生的教材,教師可以根據(jù)教學(xué)大綱需要從中選擇適合的內(nèi)容靈活使用。同時,《植物基因工程》也是學(xué)生拓寬知識、激發(fā)專業(yè)興趣、啟蒙創(chuàng)新的深入閱讀資料。
全球生物技術(shù)的快速發(fā)展使生命科學(xué)進入了大科學(xué)、大數(shù)據(jù)時代,其影響力遠超人們想象。生物科技創(chuàng)新成果層出不窮,產(chǎn)業(yè)大軍厲兵秣馬,無不預(yù)示著生物產(chǎn)業(yè)春天已然來臨。生物醫(yī)藥、生物農(nóng)業(yè)及生物產(chǎn)品制造“三足鼎立”的格局基本形成;蚬こ淌巧锎髸r代的開拓者,其中植物基因工程與農(nóng)業(yè)發(fā)展、人民生活息息相關(guān),從而得到了高度重視,產(chǎn)業(yè)化的進程急速遞增。1996年至2012年的17年間,全球種植以抗病蟲、抗除草劑性狀為主的轉(zhuǎn)基因作物面積從170萬hm真增長到1.7億hm2,增長了近100倍,創(chuàng)造了一千億美元價值,相當(dāng)于節(jié)約了16.3億畝耕地;減少了4.73億化學(xué)農(nóng)藥的使用,業(yè)績舉世矚目。這一嶄露頭角的新興產(chǎn)業(yè)方興未艾,解決全球糧食危機寄希望于植物基因工程的未來。植物基因工程與歷史上其他的重大農(nóng)業(yè)技術(shù)相比,如化學(xué)革命從有機肥到無機肥的推廣用了半個多世紀(jì),可見轉(zhuǎn)基因發(fā)展之快。在生命科學(xué)家眼中,植物基因工程是一項給人類帶來福祉的偉大技術(shù),也是將為農(nóng)業(yè)譜寫文明新篇章的技術(shù)。直至今日,聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織對30年前獲得第一株轉(zhuǎn)基因植物的三位科學(xué)家(有的科學(xué)家已去世)授予了崇高“世界糧食獎”,獎勵他們對世界農(nóng)業(yè)的巨大貢獻,這也是首次對轉(zhuǎn)基N'f乍物的高度肯定。農(nóng)業(yè)生物科技新時代已經(jīng)來臨,全球農(nóng)業(yè)生物育種和產(chǎn)業(yè)化發(fā)展已進入戰(zhàn)略機遇期。
我國已開展2。多年轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究,擁有重要基因的自主知識產(chǎn)權(quán)和核心技術(shù),在棉花、水稻、玉米等作物轉(zhuǎn)基因應(yīng)用研究方面,已形成優(yōu)勢與特色,達到國際先進水平。我國種植的棉花中8。%是轉(zhuǎn)基因抗蟲棉,減少了約8。%的農(nóng)藥使用量。我國對植物基因工程高度重視,2008年投巨資啟動了“十一五”和“十二五”植物基因工程育種專項,已對7種轉(zhuǎn)基因植物發(fā)放了商品化生產(chǎn)許可,有力地推動了我國植物基因工程產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。 科技發(fā)展,人才為本。早在1993年,本書編者、國務(wù)院特殊津貼專家王關(guān)林教授在美國從事植物基因工程研究時就致力于編寫植物基因工程專著,旨在加快我國人才培養(yǎng)。于1998年他編著了第一部專著《植物基因工程原理與技術(shù)》,2002年又改編出版了《植物基因工程》第二版并多次重印。在此基礎(chǔ)上,2008年根據(jù)我國教育部的教材建設(shè)規(guī)劃要求,由專家組評審,教育部審批,王關(guān)林教授又承擔(dān)了編寫我國普通高等教育“十一五”國家級規(guī)劃教材《植物基因工程》的專項任務(wù)。該書是我國植物基因工程領(lǐng)域內(nèi)的第一本高等院校統(tǒng)編教材,于2009年由科學(xué)出版社出版后,被中國科學(xué)院研究生院及多所大學(xué)遴選為本科高年級學(xué)生和研究生的教科書,使用五年來多次得到好評。為緊跟生物科技大時代的發(fā)展,導(dǎo)人近期植物基因工程的創(chuàng)新成果,在第一版的基礎(chǔ)上,編者匯集近代的新理論、新技術(shù)及其產(chǎn)業(yè)化進展,編寫了系統(tǒng)論述植物基因工程基礎(chǔ)理論及其原理與技術(shù),教學(xué)科研兩用的新作——《植物基因工程》第二版,以克服兩者脫節(jié)的弊病,提高本書的使用率。教材是傳授知識的載體,是培養(yǎng)人才的保證。編者深知責(zé)任重大,求賢為業(yè),竭誠邀請了來自中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所、中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院、北京大學(xué)、清華大學(xué)等院校教學(xué)科研一線的教授、專家、中青年博士參加編寫,集成他們的淵博學(xué)識和真知灼見,提高著作水平。 本書保持了原專著和第一版教材的特點:強化基礎(chǔ)理論,重視知識體系;融合學(xué)術(shù)創(chuàng)新,匯集科技成果;做到理論與技術(shù)結(jié)合,理論與實踐結(jié)合,理論與應(yīng)用結(jié)合;注意激發(fā)讀者的專業(yè)興趣和激情,培養(yǎng)創(chuàng)新能力。本書以植物基因工程的操作程序為主線循序展開,逐漸深入,在論述植物基因工程學(xué)科理論的基礎(chǔ)上,系統(tǒng)闡明了植物基因工程各程序的原理與技術(shù),使本書既具有較高的理論性,又具有較強的實用性和可操作性,從而構(gòu)成植物基因工程完整的理論體系,也為植物基因工程學(xué)科的確立奠定基礎(chǔ)。 新版《植物基因工程》中刪除了“植物基因工程實驗技術(shù)篇”,擬將該內(nèi)容獨立編寫成《植物基因工程實驗指南》,與本書配套,本書改編的主要內(nèi)容:一是在第一篇植物基因工程分子生物學(xué)中新增了第4章植物基因變異分子生物學(xué),首次綜述了植物基因損傷、突變與修復(fù)的分子機制及其與轉(zhuǎn)基因的同理性,從而深化了植物基因工程的基礎(chǔ)理論。 ……
目錄
前言 緒論 植物基因工程概述 1 1 植物基因工程的定義 1 2 植物基因工程的研究發(fā)展歷史 2 2.1 植物基因工程理論形成期 2 2.2 植物基因工程的問世期 3 2.3 植物基因工程的發(fā)展期 4 3 植物基因工程的理論基礎(chǔ)及技術(shù)路線 4 3.1 理論基礎(chǔ) 4 3.2 植物基因工程的技術(shù)基礎(chǔ) 5 3.3 植物基因工程的技術(shù)路線 5 4 植物基因工程研究的內(nèi)容 6 4.1 植物基因工程的基礎(chǔ)理論研究 6 4.2 植物基因工程的應(yīng)用研究 6 5 植物基因工程的發(fā)展前景 7 復(fù)習(xí)題 8 名詞解釋 8 問題 8 第一篇 植物基因分子生物學(xué) 第1章 植物基因組的結(jié)構(gòu)功能及特點 10 1 植物基因組與基因組學(xué)的基本概念 10 1.1 植物基因組的定義 10 1.2 基因組學(xué)的概念 10 2 植物基因組的結(jié)構(gòu)特點 11 2.1 植物基因組的大小與C值復(fù)雜性 11 2.2 植物基因組的簡單序列 11 2.3 植物基因組的重復(fù)序列 11 2.4 植物基因組的多態(tài)性 13 2.5 植物基因組的密碼偏愛性 13 3 植物細胞三套基因組的結(jié)構(gòu)功能 14 3.1 植物細胞核基因組的結(jié)構(gòu)特點 14 3.2 植物線粒體基因組的結(jié)構(gòu)特點 14 3.3 植物葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)特點 15 3.4 植物細胞三套基因組的結(jié)構(gòu)功能比較 15 4 植物細胞三套基因組的遺傳關(guān)系 16 4.1 三套基因組的混源DNA 16 4.2 葉綠體中蛋白質(zhì)的基因編碼及核質(zhì)調(diào)控 16 4.3 線粒體中蛋白質(zhì)的基因編碼及核質(zhì)調(diào)控 17 4.4 植物細胞三套基因組之間的相互調(diào)控 17 復(fù)習(xí)題 18 名詞解釋 18 問題 18 第2章 植物基因的分子結(jié)構(gòu)功能及特點 19 1 植物細胞核基因的分子結(jié)構(gòu)功能及特點 19 1.1 植物細胞核基因的基本結(jié)構(gòu) 19 1.2 植物細胞核基因的分子結(jié)構(gòu)特點 19 1.3 植物細胞核基因的功能及類型 22 2 植物葉綠體基因的分子結(jié)構(gòu)功能及特點 22 2.1 葉綠體基因的基本結(jié)構(gòu) 22 2.2 葉綠體基因的分子結(jié)構(gòu)特點 22 2.3 葉緣體基因表達調(diào)控特點 23 3 植物線粒體基因的分子結(jié)構(gòu)功能及特點 23 3.1 線粒體基因分子結(jié)構(gòu)特點 23 3.2 線粒體基因的表達調(diào)控特點 24 4 植物核基因、葉綠體基因和線粒體基因結(jié)構(gòu)功能的比較 24 復(fù)習(xí)題 25 名詞解釋 25 問題 25 第3章 植物基因的表達調(diào)控特點 26 1 植物基因表達在染色質(zhì)水平上的調(diào)控特點 26 1.1 植物染色質(zhì)MAR的調(diào)控 26 1.2 DNase I超敏位點的調(diào)控 27 1.3 DNA甲基化對基因表達的調(diào)控 27 2 植物基因表達在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控特點 27 2.1 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控 27 2.2 增強子、沉默子及Kozak序列調(diào)控 28 3 植物基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控特點 28 3.1 選擇性剪接 28 3.2 小分子RNA的調(diào)控特點 28 4 植物基因翻譯水平的調(diào)控特點 29 4.1 調(diào)控因子的磷酸化和脫磷酸化調(diào)節(jié) 30 4.2 前導(dǎo)序列調(diào)控 30 4.3 移碼和選讀 30 5 翻譯后水平調(diào)控特點 30 5.1 多肽鏈折疊調(diào)控 30 5.2 肽鏈的修飾調(diào)控 30 5.3 蛋白質(zhì)的降解 31 復(fù)習(xí)題 32 名詞解釋 32 問題 32 第4章 植物基因變異分子生物學(xué) 33 1 植物基因組變異 33 1.1 染色體組的倍性變異 33 1.2 同源染色體配對錯誤性變異 33 1.3 有性雜交基因重組變異 33 2 植物基因變異 33 2.1 DNA損傷 33 2.2 基因突變 35 3 植物DNA損傷、突變及修復(fù)重組 36 3.1 直接修復(fù) 36 3.2 切除修復(fù) 36 3.3 錯配修復(fù) 36 3.4 雙鏈斷裂修復(fù) 37 3.5 跨損傷DNA合成 37 4 植物基因變異的生物學(xué)效應(yīng)及其應(yīng)用 37 4.1 性狀改良 37 4.2 新品種培育 38 5 植物轉(zhuǎn)基因與基因變異的同理性分析 38 復(fù)習(xí)題 38 名詞解釋 38 問題 38 部分近期參考文獻 39 第二篇 植物基因工程的目的基因 第5章 抗植物蟲害基因及其應(yīng)用 42 1 微生物來源的抗蟲基因及其應(yīng)用 42 1.1 加基因 42 1.2 膽固醇氧化酶基因 44 1.3 營養(yǎng)殺蟲蛋白基因 44 1.4 其他微生物來源的抗蟲基因 44 2 植物來源的抗蟲基因及其應(yīng)用 45 2.1 蛋白酶抑制劑基因 45 2.2 植物凝集素基因 46 2.3 淀粉酶抑制劑基因 47 2.4 系統(tǒng)肽基因 47 2.5 其他植物來源的抗蟲基因 47 3 動物來源的抗蟲基因及其應(yīng)用 48 3.1 星蟲特異性神經(jīng)毒素基因 48 3.2 其他動物來源的抗蟲基因 48 4 非蛋白質(zhì)類殺蟲劑調(diào)控基因 48 5 抗蟲基因的互補和協(xié)同作用 49 復(fù)習(xí)題 49 名詞解釋 49 問題 49 第6章 抗植物病毒基因及其應(yīng)用 50 1 病毒基因及其應(yīng)用 50 1.1 病毒基因介導(dǎo)的抗性機制 50 1.2 cp基因及其應(yīng)用 50 1.3 非病毒結(jié)構(gòu)基因及其應(yīng)用 52 1.4 缺陷干擾RNA 53 1.5 病毒衛(wèi)星RNA 53 1.6 核酶基因 53 2 植物體內(nèi)的抗病毒基因及其應(yīng)用 54 2.1 病程相關(guān)蛋白基因 54 2.2 核糖體失活蛋白基因 54 2.3 其他植物內(nèi)源基因 55 3 干擾素基因及其應(yīng)用 55 3.1 干擾素的抗病毒原理 56 3.2 干擾素基因的應(yīng)用 56 4 抗體基因及其應(yīng)用 56 4.1 抗體基因的抗病毒原理 56 4.2 抗體基因在植物中的應(yīng)用 56 復(fù)習(xí)題 57 名詞解釋 57 問題 57 第7章 抗植物真菌病害基因及其應(yīng)用 58 1 抗菌物質(zhì)相關(guān)基因及其應(yīng)用 58 1.1 植物抗毒素(植保素)基因及其應(yīng)用 58 1.2 核糖體失活蛋白基因及應(yīng)用 58 1.3 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因及其應(yīng)用 59 2 病程相關(guān)蛋白基因及其應(yīng)用 59 2.1 病程相關(guān)蛋白種類 59 2.2 病程相關(guān)蛋白基因及其應(yīng)用 59 3 植物抗真菌病R基因及其應(yīng)用 62 3.1 植物抗真菌病R基因的作用機理 62 3.2 植物抗真菌病R基因功能及應(yīng)用策略 63 3.3 植物抗真菌病R基因及其應(yīng)用 63 4 植物系統(tǒng)獲得性抗性的抗病基因及其應(yīng)用 64 4.1 SAR的作用機制 64 4.2 SAR的誘導(dǎo)基因 64 復(fù)習(xí)題 66 名詞解釋 66 問題 66 第8章 抗植物細菌病害基因及其應(yīng)用 67 1 病原菌白身的抗性基因及其應(yīng)用 67 1.1 作用原理 67 1.2 oct基因和tta基因及其應(yīng)用 67 2 抗菌肽基因及其應(yīng)用 67 2.1 抗菌肽的分子結(jié)構(gòu)及其抗菌譜 67 2.2 抗菌肽的殺菌機制 68 2.3 抗菌肽基因的應(yīng)用 68 3 防御素基因及其應(yīng)用 68 3.1 防御素的結(jié)構(gòu)與功能 68 3.2 防御素np-1基因及其應(yīng)用 69 3.3 美洲商陸Pa-afp基因及其應(yīng)用 69 4 溶菌酶基因及其應(yīng)用 69 5 病原相關(guān)蛋白基因及其應(yīng)用 69 5.1 PR蛋白的基本結(jié)構(gòu)和功能 69 5.2 番茄pto基因的結(jié)構(gòu)與功能 70 5.3 番茄ptil基因的結(jié)構(gòu)與功能 70 6 植物保衛(wèi)素合成酶基因及其應(yīng)用 70 6.1 化合物保衛(wèi)素的功能及其合成酶基因 70 6.2 活性氧的抗菌功能及其調(diào)控基因 70 7 類甜蛋白基因及其應(yīng)用 71 7.1 類甜蛋白的成分和結(jié)構(gòu) 71 7.2 TLP的作用機制和應(yīng)用 71 7.3 tho基因的結(jié)構(gòu)與功能 71 復(fù)習(xí)題 71 名詞解釋 71 問題 71 第9章 抗非生物脅迫基因及其應(yīng)用 72 1 耐除草劑基因及其應(yīng)用 72 1.1 抗EPSPS抑制劑基因 72 1.2 抗ALS抑制劑基因 73 1.3 草銨膦乙酰轉(zhuǎn)移酶基因 73 2 抗非生物逆境基因及其應(yīng)用 73 2.1 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)合成酶基因及其應(yīng)用 73 2.2 抗氧化保護酶基因及其應(yīng)用 74 2.3 LEA蛋白基因及其應(yīng)用 75 2.4 抗逆相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因及其應(yīng)用 75 2.5 信號因子及其應(yīng)用 77 3 抗寒基因及其應(yīng)用 78 3.1 抗凍蛋白基因 78 3.2 提高生物膜流動性的蛋白質(zhì)基因 79 3.3 環(huán)境因素誘導(dǎo)表達的植物抗寒相關(guān)基因 79 4 耐瘠薄基因及其應(yīng)用 80 4.1 耐低磷候選基因及其應(yīng)用 80 4.2 耐低鉀候選基因及其應(yīng)用 81 復(fù)習(xí)題 81 名詞解釋 81 問題 81 第10章 影響作物產(chǎn)量、品質(zhì)的基因及其應(yīng)用 82 1 影響作物產(chǎn)量的基因及其應(yīng)用 82 1.1 植物光合作用機制及提高作物產(chǎn)量的設(shè)想 82 1.2 影響作物光合作用的基因及其應(yīng)用 82 1.3 植物產(chǎn)量形成的相關(guān)基因 84 2 影響作物品質(zhì)的基因及其應(yīng)用 85 2.1 谷物種子貯藏蛋白基因及其應(yīng)用 85 2.2 影響淀粉品質(zhì)的基因及其應(yīng)用 86 3 調(diào)控果實成熟基因及其應(yīng)用 87 3.1 多聚半乳糖醛酸酶 87 3.2 果膠酯酶 87 3.3 果膠裂解酶 88 3.4 纖維素酶 88 3.5 脂氧合酶 88 3.6 乙烯合成相關(guān)酶類 88 4 改良脂肪酸組成的基因及其應(yīng)用 88 4.1 植物飽和脂肪酸合成途徑及其改造 88 4.2 植物不飽和脂肪酸的合成途徑及其改造 90 4.3 三酰甘油組裝酶及其改造 90 4.4 影響種子含油量的調(diào)控因子 90 5 植物甜味蛋白及其應(yīng)用 90 5.1 甜味蛋白的基因工程 90 5.2 環(huán)化糊精糖苷轉(zhuǎn)移酶基因及其應(yīng)用 91 復(fù)習(xí)題 91 問題 91 第11章 調(diào)控植物生長發(fā)育的基因及其應(yīng)用 92 1 植物激素基因?qū)χ参锷L發(fā)育的調(diào)控及其應(yīng)用 92 1.1 生長素相關(guān)基因 92 1.2 細胞分裂素基因 93 1.3 赤霉素基因 93 2 光信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因?qū)χ参镄螒B(tài)建成的調(diào)控及其應(yīng)用 94 2.1 光受體基因?qū)π螒B(tài)建成的調(diào)控 94 2.2 cop1基因及其對光形態(tài)建成的負調(diào)控 95 2.3 hy5基因及其對光形態(tài)建成的正調(diào)控 95 3 調(diào)控胚胎發(fā)育及體細胞再生的基因及應(yīng)用 95 3.1 調(diào)控胚胎發(fā)育的基因 95 3.2 胚胎發(fā)育基因在體細胞再生中的應(yīng)用 96 4 調(diào)控葉片發(fā)育、衰老的基因及其應(yīng)用 96 4.1 調(diào)控葉片發(fā)育的基因 96 4.2 調(diào)控葉片衰老的基因 97 5 調(diào)控植物花發(fā)育、衰老的基因及應(yīng)用 98 5.1 調(diào)控植物花發(fā)育的基因 98 5.2 調(diào)控植物花衰老的基因及其應(yīng)用 99 6 植物雄性不育基因及其應(yīng)用 99 6.1 創(chuàng)建植物雄性不育的基因 99 6.2 雄性不育保持及恢復(fù)相關(guān)基因 100 復(fù)習(xí)題 101 名詞解釋 101 問題 101 第12章 植物生物產(chǎn)品基因工程 102 1 植物基因工程生物反應(yīng)器 102 1.1 植物基因工程生物反應(yīng)器的優(yōu)點 102 1.2 植物基因工程產(chǎn)品的表達定位 102 2 酶合成植物基因工程 103 3 脂肪合成植物基因工程 104 3.1 不飽和脂肪酸的基因調(diào)控 104 3.2 飽和脂肪酸的基因調(diào)控 104 4 淀粉合成植物基因工程 105 4.1 催化淀粉合成的酶及其基因 105 4.2 改造或生產(chǎn)特定結(jié)構(gòu)淀粉的基因 106 5 可降解塑料(PHA)合成植物基因工程 107 5.1 生物可降解塑料PHB的結(jié)構(gòu)功能 107 5.2 PHA的生物合成及其基因調(diào)控 108 5.3 利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)PHA的策略 108 復(fù)習(xí)題 109 問題 109 第13章 植物醫(yī)藥基因工程及其應(yīng)用 110 1 植物醫(yī)藥基因工程概述 110 1.1 植物醫(yī)藥基因工程的發(fā)現(xiàn) 110 1.2 轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥物的優(yōu)點 110 1.3 植物醫(yī)藥基因工程宿主植物的選擇 110 1.4 重組蛋白在細胞中的定位 111 2 植物抗體基因工程及相關(guān)基因 112 2.1 抗體及其基因的結(jié)構(gòu)與功能 112 2.2 抗體在轉(zhuǎn)基因植物中的表達 113 2.3 植物抗體的應(yīng)用前景 113 2.4 植物抗體存在的問題及研究方向 113 3 植物疫苗基因工程及相關(guān)基因 114 3.1 植物疫苗基因工程目的基因的選擇 114 3.2 植物疫苗基因工程的研究進展及應(yīng)用 前景 114 3.3 植物疫苗基因工程存在的問題及策略 116 4 轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)藥用蛋白多肽 117 5 植物醫(yī)藥基因工程研究展望 117 復(fù)習(xí)題 118 名詞解釋 118 問題 119 部分近期參考文獻 120 第三篇 目的基因分離克隆 第14章 基因序列同源性克隆目的基因 124 1 基因序列同源性克隆的原理 124 1.1 基因序列同源性克隆的種類 124 1.2 基因序列同源性克隆的原理 124 2 基因序列同源性克隆的程序 124 2.1 簡并引物設(shè)計 125 2.2 克隆基因片段序列及同源性分析 126 3 目的基因全長克隆 126 3.1 cDNA末端的快速克。≧ACE技術(shù)) 126 3.2 染色體步移(chromosome walking)技術(shù) 129 4 基因序列同源性克隆的評述 130 復(fù)習(xí)題 130 名詞解釋 130 問題 130 第15章 基因芯片技術(shù)克隆目的基因 131 1 基因芯片概述 131 1.1 基因芯片的定義 131 1.2 基因芯片的特點 131 2 利用基因芯片技術(shù)分離目的基因 131 2.1 基因芯片技術(shù)分離目的基因的原理 131 2.2 基因芯片技術(shù)分離目的基因的操作流程 132 2.3 基因芯片技術(shù)在分離目的基因中的應(yīng)用 134 3 基因芯片技術(shù)的其他應(yīng)用 135 3.1 基因表達分析 135 3.2 大規(guī)模測序 135 3.3 突變體和多態(tài)性檢測 135 3.4 基因文庫作圖 135 3.5 轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測 135 3.6 基因芯片技術(shù)的評價及發(fā)展前景 135 復(fù)習(xí)題 135 名詞解釋 135 問題 135 第16章 基因文庫技術(shù) 136 1 基因文庫概述 136 2 基因文庫的類別 136 2.1 基因組文庫和cDNA文庫 136 2.2 克隆文庫及表達文庫 136 2.3 不同載體的基因文庫 137 3 植物核基因組文庫構(gòu)建 137 3.1 DNA片段的產(chǎn)生和制備 137 3.2 構(gòu)建基因文庫的載體 138 3.3 應(yīng)用X噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫 138 4 植物cDNA文庫構(gòu)建 138 4.1 mRNA的制備 138 4.2 cDNA的合成 138 4.3 cDNA與載體的連接 139 5 人工染色體文庫構(gòu)建 140 5.1 人工染色體文庫簡介 140 5.2 酵母人工染色體(YAC)文庫 140 5.3 細菌人工染色體(BAC)文庫 141 5.4 可轉(zhuǎn)化人工染色體(TAC)文庫 142 6 基因文庫篩選方法 142 6.1 核酸雜交法 142 6.2 免疫學(xué)檢測法 143 6.3 同胞選擇法 143 6.4 PCR篩選法 143 7 問題與展望 143 復(fù)習(xí)題 144 名詞解釋 144 問題 144 第17章 差異表達基因的分離技術(shù) 145 1 mRNA差異顯示技術(shù) 145 1.1 mRNA差異顯示技術(shù)的基本原理 145 1.2 mRNA差異顯示技術(shù)分離差異表達基因的基本程序 146 1.3 mRNA差異顯示技術(shù)的優(yōu)點及局限性 146 1.4 mRNA差異顯示技術(shù)的改進 147 1.5 mRNA差異顯示實驗中的注意事項 149 2 實時熒光定量PCR技術(shù)分離目的基因 150 3 RACE技術(shù)克隆全長目的基因 150 4 基因表達系列分析技術(shù)(SAGE)努離目的基因 150 4.1 SAGE的原理 150 4.2 SAGE操作程序 150 4.3 SAGE的特點分析及應(yīng)用 151 5 差減雜交(SH)與抑制性差減雜交(SSH)技術(shù)分離目的基因 151 5.1 SSH的基本原理 152 5.2 SSH的操作程序 152 5.3 SSH的優(yōu)點分析 153 5.4 SSH在基因克隆中的應(yīng)用前景 153 復(fù)習(xí)題 153 名詞解釋 153 問題 153 第18章 插入突變技術(shù)分離克隆目的基因 154 1 插入失活篩選重組體 154 1.1 根據(jù)載體表型特征選擇重組體 154 1.2 根據(jù)插入序列的表型特征篩選重組體 155 2 插入接頭突變分離克隆目的基因 155 2.1 基本原理 155 2.2 具體操作 155 3 T-DNA標(biāo)簽法分離克隆目的基因 156 3.1 基本原理 156 3.2 操作及應(yīng)用 156 4 轉(zhuǎn)座子誘變分離克隆目的基因 157 4.1 轉(zhuǎn)座子的基本概念 157 4.2 轉(zhuǎn)座子的分糞和結(jié)構(gòu)特征 157 4.3 轉(zhuǎn)座機制 158 4.4 轉(zhuǎn)座子的應(yīng)用 159 5 插入突變的其他應(yīng)用 162 復(fù)習(xí)題 162 名詞解釋 162 問題 162 第19章 圖位克隆分離目的基因 163 1 圖位克隆的基本原理 163 2 圖位克隆的基本程序 163 3 圖位克隆的主要技術(shù)環(huán)節(jié) 163 3.1 目的基因遺傳作圖群體的構(gòu)建 163 3.2 篩選與目標(biāo)基因連鎖的分子標(biāo)記 164 3.3 目的基因區(qū)域的精細定位和作圖 166 3.4 目的基因克隆 167 3.5 目的基因的鑒定 168 4 圖位克隆的研究進展 168 復(fù)習(xí)題 169 名詞解釋 169 問題 169 第20章 酵母雙雜交系統(tǒng)分離克隆目的基因 170 1 酵母雙雜交系統(tǒng)的基本原理 170 2 酵母雙雜交系統(tǒng)的內(nèi)容 171 2.1 酵母雙雜交的組成 171 2.2 酵母雙雜交的實驗?zāi)J?171 2.3 酵母雙雜交體系的寄主菌與質(zhì)粒載體 171 3 酵母雙雜交系統(tǒng)的特點分析 172 3.1 雙雜交系統(tǒng)優(yōu)點 172 3.2 酵母雙雜交系統(tǒng)應(yīng)用的局限性和存在的主要問題 173 3.3 酵母雙雜交系統(tǒng)的改進 174 4 酵母雙雜交系統(tǒng)的功能及其新技術(shù) 175 4.1 篩選與已知蛋白特異作用的成分 175 4.2 確定兩個已知有生理作用的蛋白間的作用位點或結(jié)構(gòu)域 176 4.3 酵母單雜交系統(tǒng) 176 4.4 反向雙雜交技術(shù) 176 4.5 酵母三雜交系統(tǒng) 176 5 酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用 177 復(fù)習(xí)題 178 名詞解釋 178 問題 178 第21章 功能蛋白組技術(shù)分離目的基因 179 1 功能蛋白組技術(shù)概述 179 2 蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù) 180 2.1 雙向電泳原理 180 2.2 用于功能蛋白組研究的雙向電泳系統(tǒng) 180 2.3 蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù) 181 3 功能蛋白氨基酸序列分析 183 3.1 概述 183 3.2 蛋白質(zhì)指紋質(zhì)譜分析 183 4 功能蛋白基因分離 184 4.1 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)分離目的基因 184 4.2 核酸雜交篩選法分離目的基因 185 4.3 免疫學(xué)篩選法分離目的基因 185 復(fù)習(xí)題 187 名詞解釋 187 問題 187 第22章 基因分離克隆的新技術(shù)與選擇策略 188 1 基因分離克隆的新技術(shù) 188 1.1 EST序列標(biāo)簽法分離克隆目的基因 188 1.2 EST表達標(biāo)簽法的原理 188 1.3 EST表達標(biāo)簽法的思路 188 1.4 EST表達標(biāo)簽法在植物研究中的應(yīng)用 189 2代表性差異分析(RDA) 189 2.1 gDNA-RDA 190 2.2 cDNA-RDA 190 2.3 cDNA-RDA在植物基因分離克隆中的應(yīng)用 191 3 TADSH技術(shù) 191 3.1 TADSH的基本原理 191 3.2 TADSH方法操作程序 191 3.3 TADSH方法特點 191 4 cDNA-DS技術(shù)(cDNA直選法) 192 4.1 cDNA-DS的基本原理與內(nèi)容 192 4.2 cDNA直選法的操作程序 192 4.3 cDNA-DS方法的影響因素 192 4.4 cDNA直選法的應(yīng)用及研究進展 193 5 cDNA-AFLP與cDNA-RAPD技術(shù) 193 5.1 cDNA-AFLP 193 5.2 cDNA-RAPD 194 6 基因鑒定集成法 194 6.1 IPGI技術(shù)的基本原理 194 6.2 IPGI的實驗步驟 194 6.3 IPGI技術(shù)的優(yōu)點 195 6.4 基因鑒定集成法的應(yīng)用前景 195 7 目的基因分離克隆方法的評述與選擇策略 195 7.1 植物目的基因分離克隆新方法評述 195 7.2 植物目的基因分離克隆方法的選擇策略 197 復(fù)習(xí)題 198 名詞解釋 198 問題 198 部分近期參考文獻 199 第四篇 植物基因工程載體及其構(gòu)建 第23章 植物基因工程載體 202 1 植物基因工程載體概述 202 2 植物基因工程載體命名規(guī)則及種類 202 2.1 植物基因工程載體的命名規(guī)則 202 2.2 植物基因工程載體的種類及特性 202 3 載體的基本結(jié)構(gòu) 203 4 RNA干擾表達載體 204 4.1 RNAi的分子機制 204 4.2 植物RNAi的特點 205 4.3 RNAi載體的設(shè)計及構(gòu)建 205 4.4 RNA干擾的研究與應(yīng)用展望 206 5 植物基因工程常用的質(zhì)粒載體 207 5.1 植物基因工程常用的克隆載體 207 5.2 植物基因工程常用的表達載體 209 6 植物基因工程載體改進和優(yōu)化 210 6.1 改進和優(yōu)化啟動子 210 6.2 增強翻譯效率 210 6.3 消除位置效應(yīng) 210 6.4 使用定位信號 210 6.5 利用內(nèi)含子增強基因表達 210 復(fù)習(xí)題 211 名詞解釋 211 問題 211 第24章 植物基因工程載體的標(biāo)記基因和報告基因 212 1 標(biāo)記基因 212 1.1 標(biāo)記基因概述及環(huán)境安全 212 1.2 標(biāo)記基因的分類 212 1.3 常用的選擇標(biāo)記基因 214 1.4 轉(zhuǎn)基因植物中選擇標(biāo)記基困的消除 215 2 報告基因 218 2.1 報告基因概述 218 2.2 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因(cat) 218 2.3 熒光素酶基因(luc) 218 2.4 綠色熒光蛋白基因(gfp) 219 2.5 B葡萄糖醛酸糖苷酸酶基因(gus) 219 3 標(biāo)記基因和報告基因的選擇策略 219 復(fù)習(xí)題 219 名詞解釋 219 問題 219 第25章 Ti質(zhì)粒載體及其構(gòu)建 220 1 Ti質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)與功能 220 1.1 T-DNA區(qū)域的基因結(jié)構(gòu)與功能 220 1.2 Vir區(qū)操縱子的基因結(jié)構(gòu)與功能 221 2 Ti質(zhì);蛟谵D(zhuǎn)化中的調(diào)控作用 222 2.1 單鏈T-DNA的加T 222 2.2 T鏈復(fù)合體的形成 223 2.3 T鏈復(fù)合體的轉(zhuǎn)運 223 2.4 T復(fù)合體靶向植物細胞核 224 2.5 農(nóng)桿菌染色體基因?qū)-DNA轉(zhuǎn)移的調(diào)控 224 3 Ti質(zhì)粒的改造及載體構(gòu)建 224 3.1 雙元載體系統(tǒng) 225 3.2 載體卡盒 225 4 雙元質(zhì)粒Ti載體的新技術(shù) 225 4.1 雙元Ti載體結(jié)構(gòu)的優(yōu)化 226 4.2 雙元Ti載體的發(fā)展 227 4.3 雙元Ti載體應(yīng)用的展望 230 復(fù)習(xí)題 230 名詞解釋 230 問題 230 第26章 Ri質(zhì)粒載體及其構(gòu)建 231 1 Ri質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)與功能 231 1.1 Ri質(zhì)粒的酶切圖譜 231 1.2 Ri質(zhì)粒與Ti質(zhì)粒的同源性 232 1.3 Vir區(qū)的基因結(jié)構(gòu)與功能 232 2 Ri質(zhì)粒T區(qū)的基因結(jié)構(gòu)與功能 232 2.1 農(nóng)桿堿型Ri質(zhì)粒T-DNA區(qū)特點與功能 232 2.2 甘露堿型和黃瓜堿型T-DNA區(qū)特點 234 2.3 Ri T-DNA在轉(zhuǎn)化體的整合機制 234 3 Ri T-DNA微型質(zhì)粒的構(gòu)建 235 復(fù)習(xí)題 235 名詞解釋 235 問題 235 第27章 植物病毒載體及構(gòu)建 236 1 植物病毒載體概述 236 1.1 植物病毒載體特點 236 1.2 植物病毒載體分類 236 2 植物病毒載體的構(gòu)建 241 2.1 基因替代置換 241 2.2 基因插入 242 2.3 融合抗原 242 2.4 基因互補 242 3 病毒載體的應(yīng)用及評價 243 3.1 植物病毒載體表達系統(tǒng)在植物基因工程中的應(yīng)用 243 3.2 植物病毒誘導(dǎo)的基因沉默系統(tǒng)(VIGS)在植物功能基因組研究中的應(yīng)用 244 復(fù)習(xí)題 246 名詞解釋 246 問題 246 部分近期參考文獻 247 第28章 植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立 250 1 植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的條件 250 1.1 高效穩(wěn)定的再生能力 250 1.2 較高的遺傳穩(wěn)定性 250 1.3 具有穩(wěn)定的外植體來源 251 1.4 對選擇性抗生素敏感 251 1.5 對農(nóng)桿菌侵染有敏感性 251 2 植物組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng) 251 2.1 植物組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的種類及其特性 251 2.2 植物組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)建立的程序 253 2.3 植物組織培養(yǎng)轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)建立的常見問題 255 3 植物非組織培養(yǎng)受體系統(tǒng) 258 3.1 植物生殖細胞受體系統(tǒng) 258 3.2 植物種子受體系統(tǒng) 259 3.3 植物莖尖分生細胞受體系統(tǒng) 259 3.4 植物質(zhì)體受體系統(tǒng) 259 復(fù)習(xí)題 259 名詞解釋 259 問題 259 第29章 根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì);蜣D(zhuǎn)化 260 1 根癌農(nóng)桿菌的生物學(xué)特性 260 1.1 根癌農(nóng)桿菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生活習(xí)性及寄主范圍 260 1.2 根癌農(nóng)桿菌的分類及鑒定 260 1.3 根癌農(nóng)桿菌的遺傳宿主及內(nèi)共生原理 260 1.4 根癌農(nóng)桿菌附著植物細胞的機制 261 2 根癌農(nóng)桿菌侵染植物細胞的化學(xué)機制 261 2.1 根癌農(nóng)桿菌的趨化性 261 2.2 根癌農(nóng)桿菌侵染的誘導(dǎo)物及作用機制 261 2.3 冠癭堿的化學(xué)特性及功能 264 3 根癌農(nóng)桿菌的侵染能力及其特性 266 3.1 轉(zhuǎn)化中常用的根癌農(nóng)桿菌菌系及菌株 266 3.2 影響農(nóng)桿菌侵染能力的內(nèi)在因素 267 3.3 根癌農(nóng)桿菌的侵染能力差異及植物的敏感反應(yīng) 268 4 根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化程序及操作原理 268 4.1 根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化程序 269 4.2 根癌農(nóng)桿菌的培養(yǎng)、純化、保存及工程菌液制備 269 4.3 Vir區(qū)基因活化誘導(dǎo)物的使用 270 4.4 外植體的選擇 271 4.5 外植體的預(yù)培養(yǎng)、接種及與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng) 272 4.6 外植體脫菌及選擇培養(yǎng) 273 5 根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法 274 5.1 整體植株接種共感染法 274 5.2 葉盤轉(zhuǎn)化法 275 6 根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的評述 276 復(fù)習(xí)題 277 名詞解釋 277 問題 277 第30章 發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì);蜣D(zhuǎn)化 278 1 發(fā)根農(nóng)桿菌的生物學(xué)特性 278 1.1 發(fā)根農(nóng)桿菌的宿主及轉(zhuǎn)化體的特性 278 1.2 發(fā)根農(nóng)桿菌的分類及命名 279 1.3 毛狀根是單細胞克隆體 279 1.4 發(fā)根農(nóng)桿菌的冠癭堿合成 280 2 發(fā)根農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化策略 280 2.1 共整合載體轉(zhuǎn)化 280 2.2 雙元載體轉(zhuǎn)化 280 2.3 Ri質(zhì)粒與Ti質(zhì)粒的相容性 280 3 發(fā)根農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化的方法及操作原理 280 3.1 轉(zhuǎn)化方法 281 3.2 毛狀根的培養(yǎng) 281 4 發(fā)根農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化的影響因素 281 4.1 發(fā)根農(nóng)桿菌種類之間侵染能力的差異 281 4.2 發(fā)根農(nóng)桿菌Vir區(qū)基因的影響 282 4.3 發(fā)根農(nóng)桿菌染色體基因的影響 282 4.4 宿主對發(fā)根農(nóng)桿菌侵染的敏感性 282 5 發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的應(yīng)用 282 5.1 促進生根 282 5.2 增強抗逆性 282 5.3 次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn) 282 復(fù)習(xí)題 283 名詞解釋 283 問題 283 第31章 植物病毒載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 284 1 植物病毒的生物學(xué)特性 284 1.1 植物病毒的種類及其特性 284 1.2 植物病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu) 285 2 植物病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化的原理 286 2.1 植物病毒的侵染機制 286 2.2 病毒在植物細胞內(nèi)的裝配 286 3 植物病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化的程序 287 3.1 病毒載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的基本條件 287 3.2 病毒載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的選擇策略 287 3.3 病毒載體轉(zhuǎn)化的方法 288 4 病毒載體與質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的比較 288 4.1 病毒載體與質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的異同 288 4.2 病毒載體的缺點 288 5 病毒載體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的應(yīng)用潛力 288 復(fù)習(xí)題 289 名詞解釋 289 問答題 289 第32章 DNA直接導(dǎo)入法基因轉(zhuǎn)化 290 1 化學(xué)誘導(dǎo)DNA直接轉(zhuǎn)化 290 1.1 PEG介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 290 1.2 脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 292 2 物理法誘導(dǎo)DNA直接轉(zhuǎn)化 293 2.1 電激法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 293 2.2 超聲波介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 294 2.3 顯微注射介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 295 2.4 激光微束介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 296 2.5 基因槍法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 297 2.6 低能離子束介導(dǎo)植物基因轉(zhuǎn)化 ~301 復(fù)習(xí)題 302 名詞解釋 302 問題 302 第33章 植物種質(zhì)系統(tǒng)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 303 1 花粉管通道法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 303 1.1 花粉管通道法的提出 303 1.2 花粉管導(dǎo)人的原理 303 1.3 花粉管通道法的操作程序 304 1.4 對花粉管通道法的技術(shù)評價 304 2 花粉粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 305 2.1 花粉粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化的原理 305 2.2 花粉粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化的操作程序 305 2.3 花粉;蜣D(zhuǎn)化的優(yōu)點及問題 306 2.4 花粉;蜣D(zhuǎn)化的應(yīng)用 306 3 生殖細胞浸泡法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 306 3.1 浸泡轉(zhuǎn)化法的原理 306 3.2 浸泡轉(zhuǎn)化法程序 307 3.3 浸泡轉(zhuǎn)化法的技術(shù)評價 307 4 胚囊、子房注射法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化 308 4.1 胚囊、子房注射法的原理 308 4.2 胚囊、子房注射法的操作程序 308 4.3 胚囊、子房注射法的評述 308 5 萌發(fā)種子基因轉(zhuǎn)化 309 5.1 萌發(fā)種子基因轉(zhuǎn)化的原理 309 5.2 萌發(fā)種子胚基因轉(zhuǎn)化方法 309 5.3 萌發(fā)種子基因轉(zhuǎn)化的優(yōu)缺點 309 5.4 萌發(fā)種子基因轉(zhuǎn)化的應(yīng)用前景 309 復(fù)習(xí)題 309 名詞解釋 309 問題 309 第34章 植物質(zhì)體基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 310 1 植物質(zhì)體基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)概述 310 1.1 植物質(zhì)體系統(tǒng)的定義 310 1.2 植物質(zhì)體基因轉(zhuǎn)化的研究歷史 310 1.3 植物質(zhì)體基因轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的優(yōu)越性 310 2 葉綠體基因轉(zhuǎn)化及原理 311 2.1 葉綠體基因組結(jié)構(gòu)特點 311 2.2 葉綠體的轉(zhuǎn)化方法及原理 311 2.3 葉綠體基因轉(zhuǎn)化載體的特性 311 2.4 外源基因在葉綠體基因組的整合原理 312 3 外源基因在葉綠體基因組的表達 313 4 轉(zhuǎn)化外源基因在葉綠體基因組的同質(zhì)化途徑 314 4.1 16S rRNA突變型細胞途徑 314 4.2 利用篩選標(biāo)記基因途徑 314 4.3 利用花粉管導(dǎo)入途徑 314 5 標(biāo)記基因的選擇及刪除 314 5.1 選擇篩選標(biāo)記基因 314 5.2 篩選標(biāo)記基因的刪除 315 6 葉綠體基因工程的應(yīng)用 315 6.1 提高光合效率 315 6.2 改良作物特性 316 6.3 生產(chǎn)藥物及工業(yè)生物產(chǎn)品 316 7 存在問題及展望 316 7.1 轉(zhuǎn)化效率低 316 7.2 葉綠體同質(zhì)化困難 317 7.3 展望 317 復(fù)習(xí)題 317 名詞解釋 317 問題 317 部分近期參考文獻 317 第六篇 轉(zhuǎn)基因植物的檢測 第35章 標(biāo)記及報告基因的表達檢測 320 1 抗生素抗性基因檢測 320 1.1 β-葡萄糖苷酸酶基因gus的檢測 320 1.2 氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因cat的檢測 322 1.3 77pt-II基因的檢測 323 2 抗除草劑基因檢測 324 2.1 pat基因的檢測原理 324 2.2 檢測方法 325 3 生化代謝基因檢測 325 3.1 冠癭堿合成酶基因的檢測 325 3.2 螢光素酶基因的檢測 325 3.3 二氫葉酸還原酶基因的檢測 326 4 生物安全性標(biāo)記基因檢測 326 4.1 磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(pmi)的檢測 326 4.2 木糖異構(gòu)酶基因(xyla)檢測 327 4.3 甜菜堿醛脫氫酶(BADH)基因的測定 327 4.4 綠色熒光蛋白基因gfp的檢測 328 復(fù)習(xí)題 328 名詞解釋 328 問題 328 第36章 外源基因整合檢測 329 1 外源基因整合的Southern雜交鑒定 329 1.1 植物DNA提取 329 1.2 雜交探針的制備 330 1.3 Southern印跡雜交 332 1.4 Southern印跡雜交結(jié)果分析 335 2 整合外源基因拷貝數(shù)的IPCR檢測 337 2.1 IPCR的原理 337 2.2 IPCR技術(shù)要點 337 3 整合外源基因?qū)崟r熒光定量PCR檢測 337 3.1 實時熒光定量PCR概述 337 3.2 實時熒光定量PCR的基本概念 338 3.3 實時熒光定量PCR的化學(xué)原理 338 3.4 應(yīng)用SYBR Green l法進行基因整合檢測(絕對定量分析) 340 4 整合外源基因的原位雜交 340 4.1 染色體DNA原位雜交原理 341 4.2 染色體DNA原位雜交方法 341 復(fù)習(xí)題 341 名詞解釋 341 問題 341 第37章 外源基因的表達檢測 342 1 外源基因轉(zhuǎn)錄的Northern雜交檢測 342 1.1 植物RNA提取 342 1.2 探針制備 344 1.3 Northern斑點雜交 344 1.4 Northern印跡雜交 344 2 外源基因表達的RT-PCR檢測 345 2.1 原理 345 2.2 RT-PCR反應(yīng)程序 345 3 外源基因表達蛋白的檢測 345 3.1 ELISA檢測 345 3.2 免疫熒光技術(shù)檢測 346 4 表達蛋白的含量測定 346 5 Western雜交檢測 347 5.1 Western雜交原理 347 5.2 Western雜交程序 347 5.3 Western印跡實驗設(shè)計 348 6 外源基因表達的原位雜交檢測 348 6.1 組織細胞mRNA原位雜交 348 6.2 外源基因表達蛋白的組織細胞免疫定位 349 6.3 組織印跡的Northern及Western雜交 349 復(fù)習(xí)題 350 名詞解釋 350 問題 350 第38章 轉(zhuǎn)基因植物的生物學(xué)特性檢測 351 1 轉(zhuǎn)基因植株外源基因純合和嵌合性檢測 3 5 1 1.1 轉(zhuǎn)基因植株外源基因純合體檢測 351 1.2 轉(zhuǎn)基因植株嵌合體檢測 355 2 轉(zhuǎn)基因植物遺傳多樣性檢測 355 2.1 RFI P檢測分析原理 355 2.2 RAPD檢測分析原理 356 2.3 SSR標(biāo)記分析轉(zhuǎn)基因植株的遺傳多樣性 356 3 轉(zhuǎn)基因植株的目的性狀檢測 358 3.1 生理生化檢測轉(zhuǎn)基因植物的目的性狀指標(biāo) 358 3.2 轉(zhuǎn)基因植物目的性狀的生物學(xué)鑒定 358 4 轉(zhuǎn)基因植物穩(wěn)定性檢測 359 復(fù)習(xí)題 359 名詞解釋 359 問題 359 部分近期參考文獻 360 第七篇 轉(zhuǎn)基因植物的遺傳特性及其安全性 第39章 外源DNA在轉(zhuǎn)基因植物中的整合特性 362 1 外源DNA的整合特點 362 1.1 外源DNA整合的隨機性 362 1.2 外源DNA整合的規(guī)律性 362 1.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法的整合特點 363 1.4 基因槍法的整合特點 363 1.5 花粉管通道法的整合特點 364 2 外源DNA的整合機制 364 2.1 T-DNA整合的機制 364 2.2 直接導(dǎo)入法外源DNA整合的分子機制 365 3 外源DNA的整合方式及結(jié)構(gòu)變化 367 3.1 外源DNA的整合方式 367 3.2 轉(zhuǎn)化后外源DNA的結(jié)構(gòu)變化 368 4 外源DNA整合的效應(yīng) 369 4.1 位置效應(yīng) 369 4.2 重組效應(yīng) 369 4.3 轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的效應(yīng)(劑量效應(yīng)) 370 4.4 轉(zhuǎn)基因沉默 370 5 外源基因的刪除 370 5.1 共轉(zhuǎn)化法 370 5.2 轉(zhuǎn)座子法 370 5.3 位點特異性重組法 371 5.4 染色體內(nèi)同源重組法 372 5.5 幾種方法的比較和評價 372 6 提高外源DNA有效整合的技術(shù) 372 6.1 定點重組轉(zhuǎn)基因技術(shù)簡介 372 6.2 定點重組轉(zhuǎn)基因技術(shù)的主要類型 372 6.3 位點特異性重組的作用機制 373 6.4 位點特異性重組的應(yīng)用 373 復(fù)習(xí)題 374 名詞解釋 374 問題 374 第40章 外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的表達特性 375 1 外源基因的瞬時表達 375 1.1 瞬時表達的過程 375 1.2 瞬時表達的機制 375 1.3 植物瞬時表達的技術(shù) 376 1.4 瞬時表達的應(yīng)用 376 2 外源基因的穩(wěn)定表達 377 2.1 外源基因穩(wěn)定表達的特點 377 2.2 外源基因穩(wěn)定表達的類型 377 3 同源性和異源性外漂基因的表達 378 3.1 同源性外源基因的表達 378 3.2 異源性外源基因的表達 379 4 外源基因的沉默 379 4.1 轉(zhuǎn)基因沉默的表現(xiàn) 379 4.2 轉(zhuǎn)基因沉默的機制 379 5 外源基因的整合方式對其表達的影響 381 5.1 外源基因的整合位置 381 5.2 外源基因的拷貝數(shù) 381 6 優(yōu)化外源基因表達的策略 381 6.1 啟動子的合理選擇 381 6.2 目的基因的修飾 382 6.3 信號肽序列的利用 382 6.4 特殊序列的恰當(dāng)使用 382 6.5 利用優(yōu)良的轉(zhuǎn)化方法和重組系統(tǒng) 383 復(fù)習(xí)題 383 名詞解釋 383 問題 383 第41章 外源基因的遺傳特性及其利用 384 1 外源基因的遺傳規(guī)律 384 1.1 孟德爾式遺傳 384 1.2 非孟德爾式遺傳 385 2 外源基因的遺傳穩(wěn)定性 387 2.1 轉(zhuǎn)基因在轉(zhuǎn)化細胞中的穩(wěn)定性 387 2.2 轉(zhuǎn)基因在遺傳傳遞中的穩(wěn)定性 387 2.3 轄基因植株的倍性變化 388 2.4 沉默轉(zhuǎn)基因的遺傳穩(wěn)定性 388 3 影響外源基因遺傳特性的因素 388 3.1 環(huán)境條件 388 3.2 轉(zhuǎn)化方法 389 4 轉(zhuǎn)基因材料在遺傳育種中的應(yīng)用 389 4.1 轉(zhuǎn)基因材料在遺傳學(xué)研究中的利用 389 4.2 轉(zhuǎn)基因材料的育種利用 390 4.3 轉(zhuǎn)基因材料的基因聚合利用方法 392 4.4 快速利用轉(zhuǎn)基因材料的技術(shù) 392 復(fù)習(xí)題 393 名詞解釋 393 問題 393 第42章 轉(zhuǎn)基因植物的安全性 394 1 轉(zhuǎn)基因生物安全性概述 394 1.1 生物安全的定義 394 1.2 轉(zhuǎn)基因生物的安全性評價 394 1.3 轉(zhuǎn)基因生物安全等級的劃分 395 2 轉(zhuǎn)基因植物的基因元件安全性 395 2.1 目的基因的安全性 395 2.2 標(biāo)記基因的安全性 395 2.3 調(diào)控元件的安全性 396 2.4 載體骨架序列的安全性 396 3 轉(zhuǎn)基因植物的環(huán)境安全性 396 3.1 生存競爭能力 396 3.2 基因漂移的環(huán)境影響 397 3.3 轉(zhuǎn)基因植物的功能效率評價 397 3.4 對生物多樣性的影響 397 3.5 產(chǎn)業(yè)化后的環(huán)境監(jiān)測與風(fēng)險管理 398 4 轉(zhuǎn)基因植物的食品安全性 398 4.1 轉(zhuǎn)基因食品安全 398 4.2 轉(zhuǎn)基因植物食品安全性的評價內(nèi)容 398 5 轉(zhuǎn)基因生物安全管理 399 5.1 國外轉(zhuǎn)基因生物安全管理 399 5.2 我國轉(zhuǎn)基因生物安全管理 399 6 轉(zhuǎn)基因生物安全的風(fēng)險交流 400 6.1 風(fēng)險交流的定義 400 6.2 風(fēng)險評估、風(fēng)險管理和風(fēng)險交流之間的關(guān)系 400 7 轉(zhuǎn)基因生物安全事件澄清 401 7.1 Pusztai事件 401 7.2 大斑蝶事件 401 7.3 轉(zhuǎn)基因玉米品種對大鼠腎臟和肝臟毒性事件 401 復(fù)習(xí)題 401 名詞解釋 401 問題 401 部分近期參考文獻 401 第八篇 生物信息學(xué)與植物基因工程 第43章 生物信息學(xué)概述 406 1 什么是生物信息學(xué)? 406 1.1 生物信息學(xué)概念 406 1.2 生物信息學(xué)的研究內(nèi)容 406 2 生物信息學(xué)發(fā)展簡史 408 3 生物分子數(shù)據(jù)庫 408 3.1 基因組數(shù)據(jù)庫 409 3.2 功能數(shù)據(jù)庫 409 4 生物信息學(xué)在植物基因工程中的應(yīng)用 410 4.1 生物信息學(xué)在基因信息挖掘中的應(yīng)用 410 4.2 生物信息學(xué)在基因克隆中的應(yīng)用 410 4.3 生物信息學(xué)在轉(zhuǎn)基因植物表達分析中的應(yīng)用 411 4.4 生物信息學(xué)在整合外源基因結(jié)構(gòu)功能分析中的應(yīng)用 411 復(fù)習(xí)題 411 問題 411 第44章 生物信息學(xué)與基因結(jié)構(gòu)功能分析 412 1 序列同源性分析 412 1.1 序列比對 412 1.2 進化樹分析 413 2 基因完整性分析 414 3 基因結(jié)構(gòu)域分析 414 4 啟動子分析 414 4.1 在線搜索的方法 415 4.2 本地運行方法 415 復(fù)習(xí)題 416 問題 416 第45章 生物信息學(xué)與植物基因分離克隆 417 1 植物基因組與基因信息獲取 417 1.1 TAIR庫資源的獲取 417 1.2 GenBank庫資源的獲取 417 2 分子標(biāo)記和基因組數(shù)據(jù)分析 418 2.1 基因表達數(shù)據(jù)分析與候選基因篩選 418 2.2 基因芯片數(shù)據(jù)分析 418 2.3 Next-generation sequencing (NGS)數(shù)據(jù)分析 419 3 基因克隆中的生物信息學(xué)方法 421 3.1 PCR引物設(shè)計方法 421 3.2 電子克隆基因 422 復(fù)習(xí)題 424 問題 424 第46章 生物信息學(xué)與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能分析 425 1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫 425 1.1 PROSITE 425 1.2 PDB 425 1.3 SCOP 425 1.4 CATH 425 1.5 PIR和PSD 426 1.6 SWISS-PROT 426 1.7 COG 426 2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測 426 2.1 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的方法及軟件 426 2.2 蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測的方法及軟件 427 3 蛋白質(zhì)功能預(yù)測 428 3.1 蛋白質(zhì)功能預(yù)測方法 428 3.2 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系數(shù)據(jù)庫 428 復(fù)習(xí)題 429 問題 429 部分近期參考文獻 430 植物基因工程申英文名詞對照 431
緒論植物基因工程概述
自開天辟地以來,浩瀚地球驚天動地的變遷孕育著生命的誕生。在漫長的生物進化歷程中樹起的豐碑是歷史的見證(圖01)。分子生物學(xué)的問世揭示了基因是生命之源。在大自然的生物進化過程中,自然力量的脅迫驅(qū)使基因不斷發(fā)生突變、重組、轉(zhuǎn)移及選擇,從而推動生物界無止境的進化,形成了今天五彩繽紛的生物界。因此,生物進化是伴隨著基因變異的軌跡緩步而進。生命科學(xué)的飛速發(fā)展,創(chuàng)立了現(xiàn)代分子生物學(xué)。基因工程技術(shù)的建立,為人類改造生物開辟了嶄新的途徑,預(yù)示著生物進化史從自然進化產(chǎn)生人類,發(fā)展到了人類改造自然的科學(xué)頂峰時期。基因工程將使整個生物界發(fā)生重大變革,這足以說明基因工程的巨大威力。顧名思義,植物基因工程是改造植物的科學(xué),它也是與基因工程發(fā)展結(jié)伴而行的領(lǐng)先者。 圖01植物基因工程研究發(fā)展史事 1植物基因工程的定義 隨著分子生物學(xué)的誕生,基因工程問世。所謂基因工程(genetic engineering)是指從生物體中(供體)分離克隆基因或人工合成基因,再與載體DNA拼接重組,并將其導(dǎo)入到另一種生物體內(nèi)(受體),使之按照預(yù)先的設(shè)計持續(xù)穩(wěn)定表達和繁殖的遺傳操作。因此,供體、受體和載體成為基因工程的三大要素;蚩寺、重組和轉(zhuǎn)化是其三大核心技術(shù)。來自供體的基因?qū)儆谕庠椿。由于基因工程是改造生物的遺傳特性,故也稱為遺傳工程(genetic engineering)、遺傳修飾(genetic modification)及基因操作(gene manipulation)等。從工程學(xué)的范疇而言,基因工程是DNA操作技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計和應(yīng)用,包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因分離克隆、重組和載體構(gòu)建,而下游技術(shù)則涉及基因轉(zhuǎn)化、表達及受體培養(yǎng)和表達產(chǎn)物的分離提取技術(shù)。 植物基因工程是基因工程研究的一個先導(dǎo)領(lǐng)域;谥参锛毎苄缘拇_立、農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)、多種基因轉(zhuǎn)化技術(shù)的建立及植物與農(nóng)業(yè)的密切相關(guān)性,植物基因工程的發(fā)展迅速,并逐漸自成體系,成為一門理論與技術(shù)緊密結(jié)合的完整學(xué)科。確切地說,植物基因工程是植物分子生物學(xué)的一門分支學(xué)科,植物基因工程(plant genetic engineering)的定義是利用基因工程理論技術(shù),從供體分離克隆的外源基因,在體外與載體DNA重組后,經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化導(dǎo)入受體植物基因組中,并獲得有效表達及穩(wěn)定遺傳的工程。轉(zhuǎn)基因植物(genetically modified plant,GMP)是指通過基因工程技術(shù)改變基因組構(gòu)成的植物。該植物是農(nóng)作物,即稱為轉(zhuǎn)基因作物 (genetically modified crop,GMC)。轉(zhuǎn)基因生物(genetically modified organism,GMO)是廣義的,指轉(zhuǎn)基因的動物、植物及微生物。 由此可見,植物基因工程的目的意義是按照人們的愿望進行嚴(yán)密的設(shè)計,有目的地改造生物種性,培育出符合人們需求的基因工程新品種,生產(chǎn)所需的產(chǎn)品。 2植物基因工程的研究發(fā)展歷史 縱觀基因工程的發(fā)展歷程編繪了植物基因工程研究發(fā)展大世紀(jì)(圖01),圖中表明基因工程的研究是偉大的科學(xué)家遺傳學(xué)之父孟德爾(G.J.Mendel,1822~1884)從研究豌豆開始的,也是植物基因工程研究的起點。1865年,孟德爾發(fā)現(xiàn)了遺傳因子及遺傳的三大規(guī)律。令人遺憾的是,這天才的發(fā)現(xiàn)在他逝世后的半個多世紀(jì)內(nèi)幾乎無人理,直到1900年歐洲三位植物學(xué)家重新發(fā)現(xiàn)孟德爾遺傳定律,他才被公認為經(jīng)典遺傳學(xué)的奠基人。而后,孟德爾遺傳定律像不朽的神話故事流芳百世,推動著基因遺傳學(xué)的發(fā)展。除此之外,丹麥植物遺傳學(xué)家約翰森(Johannsen)在1909年提出“基因型”(genotype)和“表現(xiàn)型”(phenotype)的概念,并為基因型定下了一個單位“基因”(gene),從此正式拉開了基因工程研究的序幕。顯然,植物基因工程是基因研究的開拓者,但是植物基因工程是基因工程的一門分支學(xué)科,依托于基因工程而發(fā)展。其研究發(fā)展史同樣可以分為以下三個時期。 21植物基因工程理論形成期〖*2〗 211DNA分子結(jié)構(gòu)功能的創(chuàng)立 在孟德爾的基礎(chǔ)上,1910年,摩爾根(Morgan)在果蠅的研究中第一次提出了基因?qū)W說,鋪下了基因工程的奠基石。但是在相當(dāng)長的時間里,對基因的理解仍是抽象的,概念化的。1944年,美國的微生物學(xué)家格里菲思(Griffith)和艾弗里(Avery)等通過細菌轉(zhuǎn)化研究,證明DNA是遺傳物質(zhì),是基因的載體。DNA的真正身份得到了確認,但更大的難題出現(xiàn)了:DNA的結(jié)構(gòu)是什么樣子?此后對DNA構(gòu)型的研究成為當(dāng)時科學(xué)界最大的熱點之一。令人驚異的是能回答如此重大問題的竟是發(fā)表在英國《自然》雜志上一篇長不到一千個單詞的論文,并且論文的作者名不見經(jīng)傳:一位25歲的美國博士后沃森(Watson)和一位37歲的英國劍橋大學(xué)的研究生克里克(Crick)。更值得驚訝的是他們不是常規(guī)地進行生物實驗,而是如同小孩玩的拼圖游戲,把一張圖畫割裂后再拼復(fù)成更美的圖畫。然而一些愚昧的非議阻擋不了這篇論文的真正魅力,相反卻正是表明偉大的天才創(chuàng)新思維。1952年,英國國王學(xué)院的科學(xué)家威爾金斯(Wilkins)通過DNA分子X 衍射研究獲得了DNA結(jié)構(gòu)的重要證據(jù),但是DNA分子結(jié)構(gòu)模型仍不清楚。經(jīng)歷了10年的不懈努力,于1953年Watson和Crick開創(chuàng)性地提出了DNA分子的雙螺旋模型(圖02)。這是分子生物學(xué)發(fā)展史上如春雷一般撼動世界的偉大發(fā)現(xiàn)。從此生命科學(xué)家茅塞頓開,新的科學(xué)發(fā)現(xiàn)屢見不鮮, 各類證明DNA結(jié)構(gòu)的實驗證據(jù)紛至沓來,真是一智能滅千年愚。1954年,Crick又提出了中心法則,揭示了遺傳信息的傳遞規(guī)律。從而Watson和Crick及Wilkins這三位科學(xué)家一起獲得了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。1958年,大科學(xué)家Meselson等用超速密度離心的技術(shù)證明了DNA通 圖02Watson和Crick提出了 DNA分子的雙螺旋模型 過半保留方式復(fù)制。該實驗被譽為生物史上最漂亮的實驗之一。1961年,法國科學(xué)家Jacob和Monod提出操縱子(operon)學(xué)說,并發(fā)現(xiàn)了mRNA,同時美國科學(xué)家Nirenberg首次破譯了64種遺傳密碼,成功地揭示了遺傳信息的流向和基因表達調(diào)控的方式,從而為基因工程問世奠定了理論基礎(chǔ)。 212DNA表達、重組理論的建立 DNA雙螺旋模型的提出,遺傳密碼的破譯,mRNA及操縱子的發(fā)現(xiàn),中心法則及基因表達調(diào)控學(xué)說的確立,都發(fā)生在短短的十余年時間里?茖W(xué)家好像如夢初醒、茅塞頓開,突然讀懂了上帝撰寫的無字天書。從此,生命科學(xué)進入分子生物學(xué)的新時代。理論發(fā)展必然會指導(dǎo)實踐,應(yīng)用于生產(chǎn),因此生物技術(shù)、基因工程技術(shù)的創(chuàng)新應(yīng)運而生。 1956年,華盛頓大學(xué)教授科恩伯格(Kornberg)利用大腸桿菌的細胞液,在體外合成DNA。兩年后他又從中分離出DNA聚合酶,從而開拓了分子生物學(xué)的另一片新天地——基因操作技術(shù)。為此,諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎的桂冠一年后就獻給了科恩伯格。1970年,霍普金斯大學(xué)的科學(xué)家Smith等發(fā)現(xiàn)了限制性內(nèi)切酶,同年,Temin等發(fā)現(xiàn)了反轉(zhuǎn)錄酶,接著1973年Cobeng等建立了質(zhì)粒重組DNA技術(shù),使切割DNA成為可能,此時已萬事俱備只欠東風(fēng)。這些新的發(fā)現(xiàn)激發(fā)無數(shù)科學(xué)家產(chǎn)生了體外重組DNA,再導(dǎo)入宿主細胞,并在其中進行復(fù)制和有效表達的構(gòu)想。東風(fēng)來自美國的西海岸。斯坦福大學(xué)的教授Berg是研究DNA重組技術(shù)的元老。他研究發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒是承載外源DNA片段的理想載體,病毒和噬菌體的DNA和RNA都可以改建成載體。1974年,他在世界上最早獲得了重組有編碼哺乳動物激素基因的質(zhì)粒,并導(dǎo)入大腸桿菌,獲得了第一株基因工程菌株。1980年,Sanger因設(shè)計出一種測定DNA分子內(nèi)核酸序列的方法而與Gilbert和Berg榮獲諾貝爾化學(xué)獎。這一切DNA重組技術(shù)的創(chuàng)舉為基因工程問世做好了技術(shù)準(zhǔn)備,也為植物基因工程奠定了基礎(chǔ)。 213農(nóng)桿菌基因轉(zhuǎn)化機制的認知 率領(lǐng)植物基因工程研究發(fā)展的生長點是對植物冠癭瘤的發(fā)生機制的認識。這是自然界存在的巧奪天工的植物基因工程典范。早在1907年美國科學(xué)家布朗(Armin Bran)研究提出農(nóng)桿菌把“腫瘤誘導(dǎo)物”(tumorinducing principle,TIP)傳遞給了植物,即根瘤細胞是被農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化了的植物細胞,并推測被轉(zhuǎn)換的腫瘤誘導(dǎo)物是DNA,這就是TIP假說。這天才的推測30年后才被證實。布朗被譽為“根癌病研究之父”。1970年,法國科學(xué)家證明誘導(dǎo)物DNA是編碼氨基酸衍生物冠癭堿合成酶的基因,證實了TIP假說的正確性。但是用農(nóng)桿菌的DNA來轉(zhuǎn)化植物的嘗試接二連三地失敗。1974年,比利時科學(xué)家van Larebeke等發(fā)現(xiàn)了“農(nóng)桿菌的腫瘤誘發(fā)質(zhì)粒”(tumorinducing plasmid,Ti質(zhì)粒)。Ti質(zhì)粒的發(fā)現(xiàn)如同一劑強心針喚醒了美國西海岸華盛頓大學(xué)的科學(xué)家們。他們成立了“西雅圖根癌集團”(Seattle Crown Gall Group),全心致力于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的植物基因工程研究。然而他們同樣是經(jīng)受了失敗的困擾,多年的努力在植物的腫瘤組織中找不到Ti質(zhì)粒DNA。但是Chilton等沒有氣餒,堅持不懈,終于在1977年發(fā)現(xiàn)了“腫瘤誘導(dǎo)物”來自Ti質(zhì)粒上的TDNA(transferred DNA)。接著闡明了冠癭瘤形成的機制是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)把TDNA致病基因轉(zhuǎn)化到植物細胞,并在植物細胞中表達合成冠癭堿,供給農(nóng)桿菌生長繁殖所需的氮源,故有人將這個過程稱為分子內(nèi)共生或遺傳寄生(genetic colonisation)。這是自然界中存在的極為巧妙的植物基因工程遺傳轉(zhuǎn)化體系。這一發(fā)現(xiàn)是植物分子生物學(xué)發(fā)展史上一個重大的里程碑,也是植物基因工程新紀(jì)元的開始。 22植物基因工程的問世期 1977年,農(nóng)桿菌TDNA的發(fā)現(xiàn)及其轉(zhuǎn)化機制的闡明, 對分子生物學(xué)及基因工程都有十分重大的意義。它首次證明了單細胞生物在自然環(huán)境下能夠跨越原核生物與真核高等植物的界限發(fā)生基因重組, 至今尚未發(fā)現(xiàn)第二個類似的例子。更值得注意的是“西雅圖根癌集團”的首席科學(xué)家,美國科學(xué)學(xué)院的瑪麗·德爾·奇爾頓(Mary Dell Chilton)在論文中明確指出了這個發(fā)現(xiàn)的重要應(yīng)用價值:“這個能夠被轉(zhuǎn)移的元件可用來當(dāng)作今后高等植物基因工程研究載體的可能性是顯而易見的!睆拇酥参锘蚬こ萄芯砍蔀楫(dāng)時的熱點。 1983年1月,在邁阿密召開的植物與動物分子遺傳學(xué)討論會上發(fā)表的三個重要報告標(biāo)志著植物基因工程新紀(jì)元的開始。比利時根特大學(xué)的Mantaga教授及Monsanton公司科學(xué)家Fraley領(lǐng)導(dǎo)的小組都分別將TDNA上的致癌基因切除,代之以外源基因,實驗結(jié)果證明TDNA可以將外源基因轉(zhuǎn)入植物基因組。世界上第一株農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因植物煙草在美國圣路易斯大學(xué)誕生,與此同時,美國華盛頓大學(xué)教授Chilton領(lǐng)導(dǎo)的研究小組取得了另一項突破性的進展,將細菌的新酶素磷轉(zhuǎn)移酶(NPTⅡ)基因轉(zhuǎn)入植物細胞后,植物細胞可抗卡那霉素(Kan)。與此相關(guān)的論文分別發(fā)表于Nature,1983,303;Nature, 1983,304;EMBO, 1983。該轉(zhuǎn)基因植物煙草的獲得,標(biāo)志著植物基因工程的問世。直至當(dāng)今,國際糧農(nóng)組織對30年前揭示農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒基因轉(zhuǎn)化機制,并獲得第一株轉(zhuǎn)基因植物的三位科學(xué)家(有的科學(xué)家已去世)(圖03)授予了25萬美元的崇高世界糧食獎,獎勵他們對世界農(nóng)業(yè)的巨大貢獻——開啟農(nóng)業(yè)生物科技新時代。 圖03三位獲獎?wù)撸篗arc van Montagu、Robert Fraley和Marry Dell Chilton 23植物基因工程的發(fā)展期 1983年,第一個轉(zhuǎn)基因植物煙草成功后,各種轉(zhuǎn)基因植株的獲得如雨后春筍,轉(zhuǎn)基因技術(shù)也迅速發(fā)展。1985年,Horsch等首創(chuàng)了由根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草葉盤法轉(zhuǎn)化技術(shù)(leaf disc transformation)。198
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