本書涵蓋了動(dòng)物細(xì)胞制藥基因工程近年來的最新的關(guān)鍵技術(shù)及相關(guān)進(jìn)展，圍繞動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)藥物的關(guān)鍵技術(shù)，從動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物細(xì)胞載體、目的基因?qū)�、重組穩(wěn)定細(xì)胞株篩選和評(píng)估、重組蛋白分離純化、重組蛋白藥物鑒定與分析、重組蛋白藥物新技術(shù)等方面，介紹了動(dòng)物細(xì)胞制藥領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)及新技術(shù)。
1972年首次成功在體外完成DNA分子的重組改造，標(biāo)志著基因工程技術(shù)的誕生。目前，基因工程技術(shù)已廣泛應(yīng)用在藥物研發(fā)和生產(chǎn)領(lǐng)域，尤其是利用動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白藥物已成為現(xiàn)代生物制藥中最常用的技術(shù)手段之一。
相比細(xì)菌、酵母等表達(dá)系統(tǒng)，動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢在于能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)正確折疊，提供復(fù)雜的糖基化修飾等翻譯后加工等。目前批準(zhǔn)上市的近 80%的重組蛋白藥物來源于動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)。近30年來特別是近10年來，科研工作者圍繞動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)做了大量卓有成效的工作，重組蛋白藥物的產(chǎn)量和質(zhì)量都有很大提高。國內(nèi)的企業(yè)和科研機(jī)構(gòu)主要參考國外相關(guān)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)及自己建立的重組蛋白藥物研發(fā)流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和實(shí)施，尚無一本動(dòng)物細(xì)胞基因工程生產(chǎn)重組蛋白藥物技術(shù)方面的專著。
鑒于以上原因，在長期的科研活動(dòng)中，我們不斷總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，交流學(xué)習(xí)，在查閱國內(nèi)外大量相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合自己的實(shí)踐，編著了這本《基因工程——?jiǎng)游锛?xì)胞制藥關(guān)鍵技術(shù)》。全書共分七個(gè)章節(jié)，包括動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、動(dòng)物細(xì)胞載體、目的基因?qū)搿⒅亟M穩(wěn)定細(xì)胞株篩選和評(píng)估、重組蛋白分離純化、重組蛋白藥物鑒定與分析、重組蛋白藥物新技術(shù)等內(nèi)容。
本書可作為從事生物制藥方向的研究人員及研究生的指導(dǎo)用書，也可以作為藥學(xué)等相關(guān)專業(yè)本科生的實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)教材。參加本書撰寫的人員主要來自河南省重組藥物蛋白表達(dá)系統(tǒng)國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室、新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院、抗體藥物與靶向治療國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、國家藥品監(jiān)督管理局治療類單抗質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及華蘭基因工程有限公司的科研及生產(chǎn)工作一線人員。他們具有多年豐富的重組蛋白藥物研發(fā)、藥物質(zhì)量控制等方面經(jīng)驗(yàn)，為本書的編寫投入了大量的精力。另外，化學(xué)工業(yè)出版社編輯在本書的編輯加工中做了大量細(xì)致的工作，在此對(duì)他們表示衷心的感謝！
因著者水平有限，加之日常繁重的教學(xué)、科研等各種工作，盡管每位著者都付出了辛勤的勞動(dòng)，仍不免出現(xiàn)疏漏和不足，敬請(qǐng)各位讀者提出寶貴意見，以便再版時(shí)改正！
著者
2023年1月
第一章 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 001
第一節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)知識(shí) 002
一、基本概念 002
二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)條件 003
三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室 004
四、無菌技術(shù) 006
第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 007
一、動(dòng)物細(xì)胞凍存與復(fù)蘇 007
二、動(dòng)物細(xì)胞傳代 009
三、動(dòng)物細(xì)胞懸浮馴化及無血清培養(yǎng) 011
四、動(dòng)物細(xì)胞分批培養(yǎng) 015
五、動(dòng)物細(xì)胞補(bǔ)料分批培養(yǎng) 016
六、動(dòng)物細(xì)胞灌流技術(shù)培養(yǎng) 022
第三節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞生物特性分析 025
一、動(dòng)物細(xì)胞生長曲線和倍增時(shí)間分析 025
二、動(dòng)物細(xì)胞增殖測定 028
三、動(dòng)物細(xì)胞凋亡檢測 031
四、動(dòng)物細(xì)胞周期檢測 036
參考文獻(xiàn) 038
第二章 動(dòng)物細(xì)胞載體 041
第一節(jié) 質(zhì)粒載體構(gòu)建 042
一、目的基因獲取 042
二、限制性內(nèi)切酶酶切 046
三、目的片段和載體連接 048
四、重組子轉(zhuǎn)化 050
五、重組載體篩選 052
六、重組載體鑒定 052
第二節(jié) 病毒載體構(gòu)建 056
一、桿狀病毒表達(dá)載體 056
二、慢病毒載體 057
三、腺病毒載體 059
四、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 060
參考文獻(xiàn) 061
第三章 目的基因?qū)?065
第一節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染 066
一、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 066
二、聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)染 067
三、電穿孔轉(zhuǎn)染 068
四、影響細(xì)胞轉(zhuǎn)染的因素 069
第二節(jié) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率檢測 070
一、流式細(xì)胞儀檢測 071
二、熒光顯微鏡檢測 071
參考文獻(xiàn) 072
第四章 重組穩(wěn)定細(xì)胞株篩選和評(píng)估 075
第一節(jié) 重組穩(wěn)定細(xì)胞池篩選 076
一、常用的抗生素篩選標(biāo)記 076
二、遺傳霉素篩選 078
三、DHFR篩選 079
四、GS篩選 080
第二節(jié) 重組單克隆細(xì)胞株分離 081
一、有限稀釋法 081
二、流式細(xì)胞熒光分選技術(shù) 082
三、ClonePix 083
四、克隆環(huán)法 084
五、其他篩選方法 085
第三節(jié) 重組穩(wěn)定細(xì)胞系評(píng)估 086
一、細(xì)胞污染檢測 086
二、細(xì)胞系鑒定 087
三、外源基因整合分析 089
四、重組蛋白表達(dá)分析 098
參考文獻(xiàn) 101
第五章 重組蛋白分離純化 103
第一節(jié) 重組蛋白純化策略及設(shè)備 104
一、重組蛋白純化策略 104
二、重組蛋白純化設(shè)備 107
第二節(jié) 重組蛋白沉淀和膜分離技術(shù) 116
一、蛋白質(zhì)沉淀法 117
二、膜分離技術(shù) 118
第三節(jié) 重組蛋白分離色譜技術(shù) 119
一、親和色譜法 120
二、疏水色譜法 122
三、凝膠過濾色譜法 124
四、離子交換色譜法 126
五、反相色譜法 129
參考文獻(xiàn) 131
第六章 重組蛋白藥物鑒定與分析 135
第一節(jié) 蛋白質(zhì)理化特性 136
一、分子量測定 136
二、等電點(diǎn)與電荷異質(zhì)性分析 141
三、肽圖分析 144
四、氨基酸組成分析 145
五、N端氨基酸測序 150
六、C端氨基酸測序 152
七、二硫鍵分析 153
八、高級(jí)結(jié)構(gòu)分析 155
第二節(jié) 蛋白質(zhì)含量分析 159
一、凱氏定氮法 159
二、Lowry法 161
三、BCA法 162
四、Bradford法 164
五、紫外吸收法 166
六、高效液相色譜法 166
第三節(jié) 蛋白質(zhì)純度分析 168
一、宿主細(xì)胞蛋白殘留分析 168
二、宿主細(xì)胞DNA殘留分析 170
三、殘留抗生素檢測 172
四、其他成分檢測 173
第四節(jié) 糖基化修飾分析 181
一、分離富集親和技術(shù) 182
二、糖蛋白鑒定/糖基化位點(diǎn)的確定方法 187
三、糖鏈結(jié)構(gòu)分析 189
第五節(jié) 生物學(xué)活性測定 206
一、體外法評(píng)估 207
二、體內(nèi)法評(píng)估 211
第六節(jié) 免疫化學(xué)特性分析 213
一、親和力測定 213
二、抗原結(jié)合表位測定 217
參考文獻(xiàn) 219
第七章 重組蛋白藥物新技術(shù) 223
第一節(jié) 人工智能與蛋白藥物設(shè)計(jì) 224
一、核苷酸及蛋白質(zhì)相關(guān)數(shù)據(jù)庫 224
二、基因信息分析及密碼子優(yōu)化 226
三、蛋白質(zhì)信息分析及結(jié)構(gòu)預(yù)測 241
四、人工智能設(shè)計(jì) 255
第二節(jié) miRNA篩選與應(yīng)用 269
一、miRNA篩選 269
二、miRNA應(yīng)用 273
第三節(jié) 基因編輯技術(shù) 279
一、動(dòng)物細(xì)胞CRISPR基因敲除 279
二、動(dòng)物細(xì)胞基因敲入 289
第四節(jié) 表觀遺傳學(xué)技術(shù) 299
一、DNA甲基化分析 299
二、組蛋白修飾分析 305
三、非編碼RNA分析 314
第五節(jié) DNA與蛋白質(zhì)相互作用分析 323
一、凝膠遷移實(shí)驗(yàn) 323
二、DNaseⅠ足跡實(shí)驗(yàn) 330
三、酵母單雜交系統(tǒng) 337
四、染色質(zhì)免疫沉淀 351
五、噬菌體展示技術(shù)（DNA與蛋白質(zhì)相互作用） 354
參考文獻(xiàn) 356
附錄1 常用緩沖液及試劑的配制 363
附錄2 中英文詞匯表 369
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