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　　本書分為基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)和綜合性實(shí)驗(yàn)兩部分，其中基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)分為9章36個實(shí)驗(yàn)，是細(xì)胞生物學(xué)中最基本的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。綜合性實(shí)驗(yàn)6個，實(shí)驗(yàn)中需要綜合應(yīng)用多種研究技術(shù)，對培養(yǎng)學(xué)生的綜合能力、動手能力、分析和解決問題的能力很有幫助。《細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》可作為高等院校生命科學(xué)類專業(yè)本科細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課程的教材，特別適臺師范院校生命科學(xué)專業(yè)的學(xué)生使用，也可供相關(guān)科研及實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員參考。

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第1 部分基礎(chǔ)性實(shí)驗(yàn)
第一章顯微鏡技術(shù)
顯微鏡是觀察細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的基本工具，有了光學(xué)顯微鏡的發(fā)明才有細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)，有了石蠟切片技術(shù)和各種染色技術(shù)的發(fā)明才使得對細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)有了一定的認(rèn)識，電子顯微鏡的發(fā)明和超薄切片技術(shù)的出現(xiàn)則加深了人們對細(xì)胞細(xì)微結(jié)構(gòu)的了解。相差顯微鏡、微分干涉顯微鏡和顯微操作儀的發(fā)明使得對活細(xì)胞的觀察及外科手術(shù)操作變?yōu)榭赡�。熒光顯微鏡在核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的定位與定性研究方面發(fā)揮了重大作用。激光掃描共焦顯微鏡使得觀察活細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器和生物大分子的動態(tài)結(jié)構(gòu)及活動成為可能。
顯微鏡是細(xì)胞生物學(xué)研究中最基本的實(shí)驗(yàn)工具。掌握顯微鏡的調(diào)試和使用的基本技能，了解各種不同的光學(xué)顯微鏡及電子顯微鏡的基本原理、特點(diǎn)和應(yīng)用范圍，對于細(xì)胞生物學(xué)的學(xué)習(xí)和研究是十分必要的。
實(shí)驗(yàn)1 普通光學(xué)顯微鏡及其使用
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/span>
1. 了解普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造、基本原理、保養(yǎng)方法，掌握光學(xué)顯微鏡的使用方法。
2. 熟悉光鏡下細(xì)胞的基本形態(tài)和結(jié)構(gòu)。
【實(shí)驗(yàn)原理】光學(xué)顯微鏡由光學(xué)放大系統(tǒng)和機(jī)械裝置兩部分組成。光學(xué)系統(tǒng)一般包括目鏡、物鏡、聚光鏡、光源等；機(jī)械系統(tǒng)一般包括鏡筒、物鏡轉(zhuǎn)換器、鏡臺、鏡臂和底座等。標(biāo)本的放大主要由物鏡完成，聚光鏡能使光線照射標(biāo)本后進(jìn)入物鏡，形成一個大角度的錐形光柱。物鏡上方形成一個倒立的放大實(shí)像，目鏡將此倒像進(jìn)一步放大成像于人的視網(wǎng)膜上，形成一個正立的實(shí)像。判斷顯微鏡性能最重要的指標(biāo)是分辨率，它主要由物鏡決定，實(shí)際使用中也與聚光鏡相關(guān)。
分辨率可用下式表示：R=0.61λ/NA，R值越小，分辨率越大。λ為入射光的波長，NA為物鏡的數(shù)值孔徑。NA=n•sin（α/2），n為介質(zhì)的折射率，α為鏡口角的大小。
【實(shí)驗(yàn)用品】
1. 實(shí)驗(yàn)器具普通光學(xué)顯微鏡。
2. 實(shí)驗(yàn)試劑香柏油、鏡頭清洗液（乙醚∶無水乙醇=7∶3，或二甲苯）。
3. 實(shí)驗(yàn)材料各種動植物組織細(xì)胞或微生物永久裝片或臨時裝片。
【方法與步驟】
1. 普通光學(xué)顯微鏡的基本構(gòu)造
普通光學(xué)顯微鏡的構(gòu)造主要分為三部分：機(jī)械部分、照明部分和光學(xué)部分，詳見圖1-1。
2. 顯微鏡的使用方法
（1）聚光鏡的使用方法聚光鏡是光學(xué)顯微鏡照明光路中的重要部件，聚光鏡沒有調(diào)整好會影響顯微鏡的實(shí)際分辨率，也使視野中因雜散光的存在而產(chǎn)生暈光。
1）聚光鏡的對中①調(diào)出清晰的多邊形：將視場光圈和孔徑光圈調(diào)到最小的狀態(tài)，若顯微鏡的狀態(tài)正確，此時在視野中可以看到一個邊緣清楚的多邊形。否則，應(yīng)轉(zhuǎn)動聚光鏡的上下調(diào)節(jié)旋鈕，使聚光鏡緩慢上升或下降，使得視場中形成一個邊緣清晰的多邊形。
注意：不要經(jīng)常調(diào)節(jié)聚光鏡高度。調(diào)節(jié)好高度后，以后都不要再移動其高低位置。顯微鏡安裝好后，一般都已經(jīng)調(diào)節(jié)好高度，所以可以直接進(jìn)行下一步調(diào)節(jié)（如果找不到多邊形，可將視場光圈稍微放大，視野稍亮就可以找到）。
②多邊形調(diào)到正中心：視野中多邊形的正確位置應(yīng)該是在視野的正中心，如果不在說明光路有偏移，需要調(diào)節(jié)聚光鏡對中螺釘，使多邊形位于視野的中心。
③多邊形調(diào)成外切：將視場光圈慢慢放大，當(dāng)多邊形正好外切于視場時就是視場光圈的最佳工作位置。此時，聚光鏡的光軸與照明光路及成像光路的光軸合軸。調(diào)節(jié)好后，日常使用中不要隨意調(diào)整對中螺絲桿。
2）孔徑光圈的調(diào)節(jié)：一般顯微鏡的聚光鏡外側(cè)邊緣上均具有刻數(shù)及定位記號，便于調(diào)節(jié)聚光鏡與物鏡的數(shù)值孔徑使其相匹配，以取得最佳的分辨率。低數(shù)值孔徑的物鏡要配合低數(shù)值孔徑的聚光鏡；反之，高數(shù)值孔徑的油鏡要配合高數(shù)值孔徑的聚光鏡。若聚光鏡外側(cè)沒有標(biāo)刻數(shù)字，則先將物鏡聚焦，再取出一個目鏡，眼睛往鏡筒內(nèi)看，可見物鏡后透鏡呈一明亮的圓，若看不見孔徑光圈的輪廓像，說明孔徑過大；若僅是一個很小的明亮輪廓像，則說明孔徑過小。
當(dāng)緩慢增大孔徑剛好使物鏡后透鏡呈一明亮圓時，則聚光鏡與該物鏡的數(shù)值孔徑已相互匹配。
（2）低倍鏡的使用方法
1）取鏡和放置：顯微鏡平時存放在柜或箱中，用時從柜中取出，右手緊握鏡臂，左手托住鏡座，將顯微鏡放在自己左肩前方的實(shí)驗(yàn)臺上，鏡座后端距桌邊3.3～6.6cm為宜，便于坐著操作。
2）對光：用拇指和中指移動旋轉(zhuǎn)器（切忌手持物鏡移動），使低倍鏡對準(zhǔn)鏡臺的通光孔（當(dāng)轉(zhuǎn)動至聽到碰叩聲時，說明物鏡光軸已對準(zhǔn)鏡筒中心）。打開光圈，上升聚光鏡，調(diào)節(jié)光圈大小，調(diào)節(jié)自帶光源的亮度旋鈕以改變亮度，直到視野內(nèi)的光線均勻明亮為止。
3）放置玻片標(biāo)本：取一玻片標(biāo)本放在鏡臺上，一定使有蓋玻片的一面朝上，切不可放反，用推片器彈簧夾夾住，然后旋轉(zhuǎn)推片器螺旋，將所要觀察的部位調(diào)到通光孔的正中。
4）調(diào)節(jié)焦距：以左手按逆時針方向轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器，使鏡臺緩慢地上升至物鏡距標(biāo)本片約5mm處。應(yīng)注意在上升鏡臺時，切勿在目鏡上觀察，一定要從右側(cè)看著鏡臺上升，以免上升過多，造成鏡頭或標(biāo)本片的損壞。然后，兩眼同時睜開，在目鏡上觀察，左手順時針方向緩慢轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器，使鏡臺緩慢下降，直到視野中出現(xiàn)清晰的物像為止。
如果物像不在視野中心，可調(diào)節(jié)推片器將其調(diào)到中心（注意玻片移動的方向與視野物像移動的方向是相反的）。如果視野內(nèi)的亮度不合適，可通過升降聚光鏡的位置或調(diào)整光圈的大小來調(diào)節(jié)。如果在調(diào)節(jié)焦距時，鏡臺下降已超過工作距離（>5.40mm）而未見到物像，說明此次操作失敗，則應(yīng)重新操作，切不可盲目地上升鏡臺。
（3）高倍鏡的使用方法
1）選好目標(biāo)：一定要先在低倍鏡下把需進(jìn)一步觀察的部位調(diào)到中心，同時把物像調(diào)節(jié)到最清晰的程度，再進(jìn)行高倍鏡的觀察。
2）轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，調(diào)換高倍鏡頭：轉(zhuǎn)換高倍鏡時轉(zhuǎn)動速度要慢，并從側(cè)面進(jìn)行觀察（防止高倍鏡頭碰撞玻片），如高倍鏡頭碰到玻片，說明低倍鏡的焦距沒有調(diào)好，應(yīng)重新操作。
3）調(diào)節(jié)焦距：轉(zhuǎn)換好高倍鏡后，用雙眼在目鏡上觀察，此時一般能見到一個不太清楚的物像，可將細(xì)調(diào)節(jié)器的螺旋逆時針轉(zhuǎn)動0.5～1 圈，即可獲得清晰的物像（此時切勿再用粗調(diào)節(jié)器!）。如果視野的亮度不合適，可用聚光鏡和光圈加以調(diào)節(jié)。當(dāng)需要更換玻片標(biāo)本時，必須順時針（切勿轉(zhuǎn)錯方向）轉(zhuǎn)動粗調(diào)節(jié)器使鏡臺下降，方可取下玻片標(biāo)本。
（4）油鏡的使用方法
1）在使用油鏡之前，必須先經(jīng)低、高倍鏡觀察，然后將需進(jìn)一步放大的部分移到視野的中心。
2）將聚光鏡上升到最高位置，光圈開到最大。
3）轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，使高倍鏡頭離開通光孔，在需觀察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢轉(zhuǎn)動油鏡。在轉(zhuǎn)換油鏡時，從側(cè)面水平注視鏡頭與玻片的距離，使鏡頭浸入油中而又不以壓破玻片為宜。
4）微調(diào)焦：一般情況下，從高倍鏡轉(zhuǎn)到油鏡即可觀察到物像，用雙眼于目鏡觀察，并慢慢轉(zhuǎn)動細(xì)調(diào)節(jié)器至物像清晰為止。轉(zhuǎn)動過程中，油鏡可能會離開油滴，此時，需要再小心地將鏡頭浸入油滴中，最好使鏡頭盡量貼近玻片，然后再微調(diào)使之逐漸遠(yuǎn)離玻片，防止玻片與鏡頭的碰撞。
如果不出現(xiàn)物像或者目標(biāo)不理想要重找，在油區(qū)之外重找時的程序?yàn)椋旱捅丁弑丁顽R；在油區(qū)內(nèi)重找的程序?yàn)椋旱捅丁顽R，此時不可使用高倍鏡，以免油沾污鏡頭。
5）調(diào)節(jié)孔徑光圈和視場光圈，將孔徑光圈調(diào)到最大，與油鏡的數(shù)值孔徑相匹配，再調(diào)節(jié)視場光圈和自帶光源的旋鈕以達(dá)到最佳亮度。
6）油鏡使用完畢，將載物臺遠(yuǎn)離鏡筒，先用擦鏡紙蘸少許二甲苯將鏡頭上和標(biāo)本上的香柏油擦去，然后再用干擦鏡紙擦干凈。
【注意事項(xiàng)】
1. 持鏡時必須是右手握臂、左手托座的姿勢，不可單手提取，以免零件脫落或碰撞到其他地方。
2. 輕拿輕放，不可把顯微鏡放置在實(shí)驗(yàn)臺的邊緣，以免碰翻落地。
3. 保持顯微鏡的清潔，光學(xué)和照明部分只能用擦鏡紙擦拭，機(jī)械部分用布擦拭。
4. 水滴、乙醇或其他藥品切勿接觸鏡頭和鏡臺，如果沾污應(yīng)立即擦凈。
5. 放置玻片標(biāo)本時要對準(zhǔn)通光孔中央，且不能反放玻片，防止壓壞玻片或碰壞物鏡。
6. 不要隨意取下目鏡，以防塵土落入物鏡；也不要任意拆卸各種零件，以防損壞。
7. 使用完畢后，取下標(biāo)本片，轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器使鏡頭離開通光孔，下降鏡臺，下降聚光鏡，關(guān)閉光圈，推片器回位，蓋上外罩，放回鏡箱內(nèi)。最后填寫使用登記表。
【思考題】
1. 調(diào)節(jié)聚光鏡及使用油鏡時應(yīng)注意哪些事項(xiàng)？
2. 為什么使用高倍鏡和油鏡時，必須從低倍鏡開始？
實(shí)驗(yàn)2 光學(xué)顯微鏡標(biāo)本的制作技術(shù)及HE染色
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/span>
1. 掌握光學(xué)顯微鏡標(biāo)本的制作方法。
2. 掌握HE 染色標(biāo)本的染色特點(diǎn)，了解HE 染色的過程。
【實(shí)驗(yàn)原理】光學(xué)顯微鏡的標(biāo)本制作方法很多，常用的有：分離法、涂片法（血細(xì)胞、分離細(xì)胞或脫落細(xì)胞）、壓片法、鋪片法（疏松結(jié)締組織可撕成薄片）、磨片法（牙和骨等堅(jiān)硬組織可磨成薄片）、血管注射法、切片法，多數(shù)都需經(jīng)過染色后才能在鏡下觀察。
石蠟切片是最基本的切片技術(shù)，冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。蘇木精（hematoxylin）與伊紅（eosin）對比染色法（HE 染色）是組織切片最常用的染色方法。這種方法適用范圍廣泛，對組織細(xì)胞的各種成分都可著色，便于全面觀察組織構(gòu)造，而且適用于各種固定液固定的材料，染色后不易褪色，可長期保存。經(jīng)過HE 染色，細(xì)胞核被蘇木精染成藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)被伊紅染色呈紅色。
【實(shí)驗(yàn)用品】
1. 實(shí)驗(yàn)器具切片刀、切片機(jī)、恒溫箱、顯微鏡、溫度計(jì)、水浴鍋、溫臺、熔蠟爐、蠟杯、酒精燈、蠟鏟、展片臺、解剖刀、解剖針、解剖剪、解剖盤、培養(yǎng)皿、吸管、鑷子、單面刀片、臺木、毛筆、包埋紙盒、染色缸、蓋玻片、載玻片、玻片盤、樹膠、樹膠瓶。
2. 實(shí)驗(yàn)試劑
（1）Carnoy 固定液：甲醇∶冰醋酸=3∶1。
（2）Ehrich 蘇木精染液：取蘇木精1.0g，冰醋酸5ml，乙醇50ml，甘油50ml，硫酸鋁鉀5g，蒸餾水50ml。將蘇木精溶于少量的乙醇中，再加冰醋酸并攪拌，以加速其溶解。當(dāng)蘇木精溶解后將甘油加入并搖動容器，同時加入剩余的乙醇。硫酸鋁鉀需研磨并加熱，然后溶解于蒸餾水中，將其逐滴加入染色劑中，并不斷搖動，瓶口用紗布蓋好，置于通風(fēng)處，經(jīng)常搖動以促其成熟，待顏色變?yōu)樽霞t色時即可使用，成熟時間需2～4 周或數(shù)月之久。
（3）伊紅Y 染液：伊紅Y 1.0g，蒸餾水75ml，95%乙醇25ml，冰醋酸1 滴或2 滴。先將少量蒸餾水加入伊紅Y 中，用研缽將伊紅Y 研碎溶解，再加入全部的蒸餾水，混勻溶解后，加入乙醇、冰醋酸。
（4）甘油蛋白貼片劑：將1個雞蛋打破入碗或杯中，去蛋黃留下蛋白，用玻棒調(diào)打成雪花狀泡沫，然后用粗紙或雙層紗布過濾到量筒中，經(jīng)數(shù)小時或一夜，即可濾出透明蛋白液。然后加入等量甘油，稍稍振搖使兩者混合。最后加入水楊酸鈉1g 作防腐用�？杀４鎺讉€月。
（5）1%鹽酸乙醇液：濃鹽酸1 份，70%乙醇99 份。
（6）其他：各級乙醇（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%），二甲苯，中性樹膠。
3. 實(shí)驗(yàn)材料鼠肝、腎等動物組織。
【方法與步驟】
1. 石蠟標(biāo)本的制作
（1）取材：斷頸處死小鼠，迅速取材，組織塊厚度不超過0.5cm。
（2）固定：將組織塊浸入Carnoy固定液中進(jìn)行固定，以保持其本來的結(jié)構(gòu)。
（3）制成蠟塊。
1）脫水：為了避免組織過度收縮，脫水過程應(yīng)從低濃度乙醇開始，在70%、80%、90%、95%的乙醇中各浸6～12h，100%乙醇中3～4h。
2）透明：在二甲苯內(nèi)至組織塊透明為止。
3）浸蠟：透明后的組織塊放入熔化的石蠟中（56～60℃），浸2～3h，使石蠟充分浸入組織內(nèi)部。
4）包埋：先在模具中加入一些液態(tài)石蠟，待稍微冷卻，然后再將待包埋的組織置于石蠟之中，并排列整齊，再將塑料模具盒蓋上，最后加入少許液體石蠟，使石蠟變成固態(tài)。

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